基因组组装与注释：构建高精度参考基因组
研究利用Illumina、PacBio HiFi、Oxford Nanopore长读长测序及Hi-C技术，组装了射干（Belamcanda chinensis）的首个近端粒到端粒（near telomere-to-telomere, T2T）基因组，大小为4.18 Gb。该组装被锚定在16条染色体上，包含64个contig，contig N50达209.6 Mb。
Hi-C热图显示强烈的染色体内互作，荧光原位杂交（FISH）实验进一步独立验证了端粒和着丝粒在染色体组装的正确位置，证明了组装的高连续性和结构保真度。基因组评估指标优异，BUSCO完整性达98.70%，LTR组装指数（LAI）为17.2，均超过参考质量阈值。
基因组注释显示，约90.22%的序列为重复序列，其中长末端重复逆转录转座子（LTR-RT）占主导（77.19%），尤其是Gypsy（32.28%）和Copia（5.54%）。LTR插入时间分析揭示其在近600万年内有一次主要的扩增爆发，峰值出现在最近100万年。研究共注释了33,962个蛋白质编码基因，其中96.4%的转录本具有高编码序列（CDS）/cDNA比值（≥84%），注释BUSCO完整性达97.5%。对重复基因的分析发现，全基因组复制（WGD, 62.35%）是主要的复制模式，其次是转座复制（TRD, 22.26%）。
比较基因组与进化分析：揭示谱系特异性全基因组复制事件
通过比较射干与鸢尾科（Iridaceae）内近缘物种（如番红花/Crocus sativus）及其他单子叶植物的基因组，并结合化石标定，研究构建了系统发育树，表明射干与番红花的最近共同祖先分化时间约为6,970万年。
同义替换率（Ks）分布、同线性深度分析及分子定年结果共同揭示了射干经历了两次谱系特异性的全基因组复制事件，分别发生在大约5,460万年和2,730万年前。这些事件发生在射干与番红花分化之后。基因组自身比对显示出主要的4:4同线性模式，而与祖先单子叶植物核型（AMK-A）比较则呈现1:8的深度比，这与累积三次WGD事件（包括共享的单子叶植物τ事件）的结果一致。这些古老的WGD事件，加上近期LTR逆转录转座子的爆发，共同驱动了射干大基因组的形成。
基因家族扩张收缩分析显示，射干有675个基因家族显著扩张，525个显著收缩。对扩张家族的基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，它们主要富集在与生物胁迫防御（如对卵菌、细菌的防御反应）、非生物胁迫耐受（如盐胁迫、缺水）以及苯丙素和类黄酮（包括异黄酮）生物合成相关的通路上。这说明谱系特异性基因家族扩张丰富了射干的功能基因库，为其增强的抗逆能力和特化代谢物（如异黄酮）的生物合成能力提供了基因组基础。
O-甲基转移酶（BcOMT）的鉴定与功能：催化鸢尾素的生物合成
鸢尾素是射干药材的质量控制标志物。研究在基因组中鉴定出46个O-甲基转移酶基因（BcOMTs），其中11个在根部特异性高表达，被选为候选基因。体外酶活实验和烟草瞬时表达系统证明，BcOMT03和BcOMT33能够以二裂苔藓亭（dichotomitin）为底物，S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，催化C5和C3'位的O-甲基化反应，最终生成鸢尾素。BcOMT33主要催化生成3'-羟基-5,4',5'-三甲氧基-6,7-亚甲二氧基异黄酮，并有少量鸢尾素生成；而BcOMT03则能更高效地完成最终步骤。
动力学分析显示，两者催化效率不同：BcOMT33底物亲和力更高（K
m= 68.3 µM），但转换数较低（k
cat= 0.0431 s
-1）；BcOMT03亲和力较低（K
m= 174.6 µM），但转换率更高（k
cat= 0.389 s
-1）。
进化与同线性分析表明，BcOMTs属于COMT超家族，其中BcOMT03与已知的3’/5’-OMTs聚为一支。基因簇分析（如BcOMT01-03）显示其在射干、番红花和芦笋中保守，表明其起源早于这些物种的分化。而所有BcOMT旁系同源基因对的平均Ks值约为0.47，与射干第一次谱系特异性WGD事件的时间吻合。这些发现表明，串联重复（TD）和全基因组复制（WGD）事件共同促进了BcOMTs基因家族的扩张，从而支持了异黄酮结构多样化的产生。
UDP-糖基转移酶（BcUGT）的鉴定与功能：催化异黄酮的糖基化修饰
糖基化是射干中异黄酮苷（如鸢尾苷B、鸢尾苷A、鸢尾苷、鸢尾素苷）生物合成和积累的关键步骤。研究在基因组中鉴定出145个UGT基因。通过筛选根部/根茎高表达的候选基因，体外酶活实验证明BcUGT009、BcUGT119、BcUGT124和BcUGT032能够分别以鸢尾素元B、鸢尾素元A、鸢尾素元、鸢尾素为底物，在C7位进行O-糖基化，生成相应的异黄酮苷。这四种酶均表现出广泛的底物混杂性。烟草瞬时表达实验也验证了它们在植物体内的活性。
动力学表征显示，BcUGT009催化效率最高（kcat/Km= 46 M-1s-1），平衡了适中的底物亲和力（Km= 57.4 µM）和较高的转换率；BcUGT124亲和力最强但转换率低；BcUGT032和BcUGT119效率相对较低。同线性分析提示BcUGT119和BcUGT124可能经历了单子叶植物独立的进化。
BcUGT009的催化分子机制解析
通过计算模拟和定点突变实验，研究揭示了BcUGT009的催化机制。预测的三元复合物结构显示，底物鸢尾素元B的糖基化位点羟基与H32和D135形成氢键网络，其中H32作为催化碱，D135稳定质子化的组氨酸。UDP-葡萄糖（UDP-Glu）通过氢键和π-π堆积与周围氨基酸稳定结合。定点突变证实H32A、D135A、N386A和T308A突变会完全丧失酶活。有趣的是，对底物通道的分析发现，K404的位阻限制了口袋大小。K404A突变体显著增大了通道，其体外相对催化活性比野生型提高了2.3-7.2倍，实现了更高效的糖基转移反应。
异黄酮生物合成的遗传基础：豆科与非豆科植物的趋同进化
研究重建了射干中从苯丙氨酸到各种异黄酮产物的完整生物合成通路，涉及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合成酶（CHS）、异黄酮合酶（IFS）等上游骨架形成酶，以及下游的羟基化、甲基化和糖基化等修饰酶。通过对12个系统发育多样植物基因组中13个核心通路酶家族的比较分析发现，能够积累异黄酮的物种（包括豆科的葛根、野大豆、蒺藜苜蓿，以及非豆科的射干、小麦），其这些生物合成家族中的基因拷贝数倾向于比不积累该代谢物的物种更高。这种扩张在豆科和非豆科植物中均有出现，表明异黄酮生物合成的遗传基础可能不限于豆科，而是涉及关键酶家族的趋同或平行扩张，这为理解不同植物类群中特化代谢途径的独立进化提供了新视角。
讨论与意义：基因组进化与化学防御的协同叙事
这项研究提供的射干近T2T基因组，使其成为理解非豆科植物特化代谢进化的宝贵模型。研究发现，近期转座子爆发和两次古老的谱系特异性WGD事件共同驱动了射干大基因组的扩张，这些WGD事件可能与古气候剧变时期的环境压力有关。基因组冗余为基因家族扩张和新功能化创造了条件。显著扩张的基因家族高度富集于两个功能模块：基础胁迫响应和特化代谢生物合成（特别是苯丙素和类黄酮通路）。这种协同扩张策略代表了一种高效的进化适应，一方面增强了对环境挑战的感知和响应，另一方面提升了结构多样的异黄酮（如鸢尾苷
