摘要
全氟和多氟烷基物质（PFAS）是持久性的环境污染物，能够在人体内积累，包括卵泡液（FF）中，可能影响生殖细胞的功能。我们使用了先前在人类卵泡液中报告的这些化学物质的混合物浓度，来评估它们对小鼠卵母细胞体外成熟、DNA完整性和线粒体功能的影响。PFAS的暴露导致了减数分裂异常，表现为处于胚泡破裂（GVBD）阶段的卵母细胞比例增加，以及达到第二次减数分裂中期（MII）阶段的卵母细胞数量减少。我们证明，GVBD阶段的停滞与纺锤体组装检查点（SAC）的激活有关，因为实验性抑制SAC可以恢复卵母细胞到MII阶段的正常成熟。此外，我们观察到DNA损伤增加和氧化平衡的变化，包括还原型谷胱甘肽（GSH）水平升高和活性氧（ROS）水平降低。然而，我们发现未成熟GV阶段卵母细胞的线粒体活性、基础氧消耗（OCR）和线粒体呼吸强度增加，表明生物能量稳态受到干扰。这些发现首次表明，与人类暴露相关的PFAS混合物会干扰卵母细胞的成熟、基因组完整性和线粒体功能。获得的数据强调了进一步研究PFAS混合物毒性的必要性，特别是在与其环境存在相对应的剂量下，以及它们对女性生育能力的潜在影响。
引言
哺乳动物的雌性生殖细胞在胎儿期开始减数分裂，但其进程会在第一次减数分裂的双线期（也称为胚泡阶段）被长时间停滞。在成年雌性中，完全成熟的GV阶段卵母细胞会在每个发情周期中响应激素刺激而重新开始减数分裂。减数分裂恢复后，卵母细胞进入称为减数分裂成熟的最后阶段。这一过程的首个形态学标志是核膜的溶解，即胚泡破裂（GVB），随后是染色质浓缩和第一次减数分裂中期（MI）纺锤体的形成。第一次减数分裂的后期伴随着不对称的胞质分裂，导致第一个极体（PB1）的排出。重要的是，在某些基因组完整性受损的情况下，纺锤体组装检查点（SAC）可以阻止减数分裂成熟的进展，从而降低具有异常基因组的卵母细胞完成成熟并随后受精的风险（Polański, 2013; Lane and Kauppi 2024）。第一次减数分裂完成后，卵母细胞很快进入第二次减数分裂中期（MII），这标志着减数分裂成熟的结束。在此阶段，细胞周期再次停滞，直到精子穿透。在减数分裂成熟过程中，卵母细胞质获得了适当响应精子进入并启动发育的能力。此外，这一过程的干扰可能导致染色体分离错误或卵母细胞基因组缺陷，这些缺陷可能传递给胚胎。因此，干扰减数分裂成熟的因素可能导致不孕、流产或出生缺陷（Wang et al. 2021; Yao et al. 2023）。
全氟和多氟烷基物质（PFAS）在各种工业和消费品中广泛存在，包括化妆品、药品和食品包装材料（Ding et al. 2020）。这些化学物质可以穿过血-卵泡屏障并在卵泡液（FF）中积累（Kim et al. 2020），从而直接影响发育中的卵母细胞。在FF中最常见的PFAS如全氟辛烷磺酸盐（PFOS）、全氟辛酸（PFOA）、全氟己烷磺酸盐（PFHxS）、全氟癸酸（PFDA）、全氟庚烷磺酸盐（PFHpA）、全氟十八酸（PFUnDA）和全氟壬酸（PFNA）的浓度范围从PFUnDA的0.4 ng/ml到PFOS的22.4 ng/ml（Kim et al. 2020; Bellavia et al. 2023; Boney et al. 2026）。尽管证据有限，但最近的研究表明，像PFOS、PFOA和PFHxS这样的个别PFAS可能通过诱导氧化应激和线粒体功能障碍来影响卵母细胞功能，从而损害卵母细胞的减数分裂成熟（Hallberg et al. 2022; Zhang et al. 2022; Feng et al. 2023; Yan et al. 2025）。此外，研究表明，PFNA（Jiao et al. 2021）以及PFOS和PFOA的混合物（Yan et al. 2025）的暴露会导致卵母细胞DNA损伤。然而，流行病学研究表明，卵母细胞暴露于这些化合物的更复杂组合中。因此，了解环境相关浓度下的PFAS混合物对卵母细胞成熟的影响尤为重要，需要进一步研究。
本研究的目的是确定一种成分与人类卵泡液中检测到的PFAS混合物相似的混合物是否会影响小鼠卵母细胞在前期阶段和体外成熟过程中的功能。为此，我们分析了卵母细胞通过减数分裂成熟的进程，以及PFAS混合物对氧化应激、线粒体功能和细胞生物能量的影响。特别强调了评估PFAS暴露与卵母细胞DNA损伤之间的关联。这种损伤可能损害卵母细胞的基因组完整性，从而对胚胎发育产生不利影响，并可能导致后续代际中突变的积累。
材料与方法
试剂和处理
PFOA、PFUnDA、PFNA、PFDA、PFHpA、PFHxS从Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）购买，而PFOS则从Santa Cruz Biotechnology Inc.（美国德克萨斯州）获得。通过将所有成分溶解在细胞培养用水（WFI；Thermo Fisher Scientific, Inc.，美国）中制备了测试化合物混合物的储备溶液。将此溶液直接加入培养基中，以达到以下在人类卵泡液中报告的最终浓度：PFOS 224 ng/ml、PFOA 145 ng/ml、PFHxS 213 ng/ml、PFDA 9 ng/ml、PFHpA 6 ng/ml、PFUnDA 4 ng/ml和PFNA 20 ng/ml（Kim et al. 2020; Bellavia et al. 2023; Boney et al. 2026）。
动物
3-6个月大的成熟雌性OF1杂交小鼠（n=76）被饲养在控制温度（22°C ± 2°C）和光照（12小时/天）条件的动物设施中，提供充足的水和食物。实验按照国家关于用于科学和教育目的的动物保护法规进行，并符合2010年9月22日的欧盟理事会指令2010/63/EU。实验报告遵循ARRIVE指南（https://arriveguidelines.org）。
卵母细胞分离
小鼠被处死，卵巢被解剖，放入M2培养基（M7167；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），并用尖镊子尖端刺破以将卵母细胞从窦状卵泡中释放到培养基中。如果存在，用轻柔的移液器去除卵母细胞周围的 cumulus 细胞。只有处于GV阶段的卵母细胞被选用于进一步实验。根据实验方案，卵母细胞在进一步处理前被保持在GV阶段24小时（实验1，实验3），或立即放入培养基中进行减数分裂成熟（实验2）。
图1
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
实验设计
实验1. 24小时PFAS暴露对GV阶段卵母细胞的影响（每组13-15个）（图1）。从卵巢中分离出的卵母细胞被放置在10 µL的M2培养基（对照组）或含有PFAS混合物的M2培养基（实验组，Mix）中，并覆盖矿物油（M8410，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）。向两种培养基中加入200 µM N6,2′-O-二丁基腺苷3′,5′-环单磷酸钠盐（dbcAMP；D0627，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），以保持卵母细胞在GV阶段。卵母细胞在37°C、含5% CO2的空气中培养24小时，然后测量线粒体活性、细胞内GSH浓度、ROS水平和生物能量谱以及DNA损伤。
实验2. 在卵母细胞体外减数分裂成熟（IVM）期间18小时PFAS暴露的影响（图1）。从卵巢中分离出GV阶段的卵母细胞（每组15-16个）后，将它们放置在10 µL的M2培养基（对照组）或含有Mix的M2培养基（处理组）中，并覆盖矿物油，在37°C、含5% CO2的空气中培养以允许减数分裂成熟。18小时后，评估减数分裂成熟的效率，仅收集达到MII阶段的卵母细胞进行线粒体活性、细胞内GSH浓度和ROS水平的测量。
实验3. 在GV阶段连续暴露24小时后，再进行18小时减数分裂成熟暴露的影响（图1）。GV阶段的卵母细胞（每组12-14个）被放置在10 µL的M2培养基（对照组）或含有Mix的M2培养基（实验组）中。在两组中，通过上述方法向培养基中添加dbcAMP以保持卵母细胞在GV阶段。含有卵母细胞的培养皿覆盖矿物油，并在37°C、含5% CO2的空气中放置24小时。24小时后，用M2培养基洗涤卵母细胞以去除dbcAMP（2×5分钟），然后放入新鲜的M2培养基（对照组）或含有Mix的新鲜M2培养基中，在37°C、含5% CO2的空气中培养18小时以允许减数分裂成熟。18小时培养期结束后，评估减数分裂成熟的效率，并对达到MII阶段的卵母细胞进行线粒体活性、细胞内GSH浓度和ROS水平的测量。
小鼠卵母细胞体外减数分裂成熟的评估
在体外培养18小时后检查卵母细胞，以评估减数分裂成熟的整体效率。根据此结果，将卵母细胞分为三类：GV卵母细胞（未恢复减数分裂的卵母细胞）、GVBD卵母细胞（已恢复减数分裂但未排出第一个极体的卵母细胞）和MII卵母细胞（已排出第一个极体并停留在第二次减数分裂中期（MII）的卵母细胞，从而完成减数分裂成熟）。
小鼠卵母细胞线粒体活性和线粒体膜电位的评估
为了评估线粒体活性，用浓度为500 nM的MitoTracker Deep Red（M22426；Invitrogen，英国佩斯利）标记卵母细胞，并在37°C下孵育30分钟。然后用Axiocam 503明场/荧光显微镜（Zeiss，德国耶拿）在644和665 nm的激发和发射波长下获取卵母细胞的图像。使用ImageJ软件（美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院）分析荧光图像。手动勾勒单个卵母细胞的轮廓以计算平均信号强度。从四个不同方向测量卵母细胞周围的四个区域的信号强度，并取平均值以获得每张图像的平均背景信号强度。从每张图像中分析的每个卵母细胞的平均信号强度中减去平均背景强度。数据是相对于每次实验中对照卵母细胞的平均荧光强度（设定为100）报告的。评估小鼠卵母细胞中的活性氧（ROS）水平和细胞内谷胱甘肽（GSH）浓度。ROS水平是使用10 µM荧光探针2–7′-二氯荧光素二乙酸酯（H2DCFDA；D399；Invitrogen，Paisley，英国）来测定的。卵母细胞在含有该染料的M2培养基中孵育30分钟，温度为37°C，然后用M2培养基洗涤两次，之后使用Axiocam 503明场/荧光显微镜进行成像，激发波长为495 nm，发射波长为527 nm。为了评估GSH浓度，卵母细胞在含有50 µM单氯联胺（mBCl；69899；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，美国）的M2培养基中孵育45分钟，温度同样为37°C。之后，用M2培养基洗涤两次，再次使用Axiocam 503明场/荧光显微镜进行成像，激发波长为380 nm，发射波长为461 nm。荧光图像的分析方法如上所述，使用ImageJ软件进行。
测量核DNA和线粒体DNA损伤
单个卵母细胞中的核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）损伤数量是使用LORD-Q（基于长时实时PCR的DNA损伤定量）方法（Lehle等人，2014年；Dannenmann等人，2017年）根据先前发表的协议（Kotarska等人，2024年）来评估的。简要来说，对照组和PFAS暴露组的MII期卵母细胞分别用含有蛋白酶K（0.2 mg/ml；1019-20-5；A&A Biotechnology，Gdańsk，波兰）的40 µl Taq缓冲液（B38；Thermo Scientific，Waltham，MA，美国）在55°C孵育30分钟，然后在95°C孵育10分钟。所得的裂解液直接用作实时PCR反应的DNA模板。对于nDNA，扩增了重复L1元件的长片段（探针）和内部嵌套的短片段（标准化对照）（L1-LORD-Q）。对于mtDNA，扩增了线粒体基因组中的长片段和嵌套的短片段（经典LORD-Q）。引物序列见表1。Taq聚合酶和标准SYBR Green I染料用于扩增和短片段的实时检测。为了确保长片段的正确扩增，使用了高保真度和快速的PrimeSTAR GXL聚合酶，并结合了ResoLight染料。两种基因组的短片段反应混合物包含：2 µl的DNA模板，PowerUp SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems，Waltham，MA，美国），以及每种引物200 nM，每孔总体积为10 µl。实时分析使用QuantStudio 5实时PCR系统（Applied Biosystems）进行。循环条件如下：2分钟在50°C，2分钟在95°C，然后是40个循环，每个循环15秒在95°C和1分钟在60°C，随后进行熔解曲线分析。两种基因组的长片段反应混合物包含：2 µl的DNA模板，0.4 µl的PrimeSTAR GXL聚合酶（Takara，Kusatsu，日本），PrimeSTAR GXL缓冲液（Takara），dNTP混合物（每种200 µM）（Takara），以及0.05 µl的ResoLight染料（Roche，Basel，瑞士），每孔总体积为10 µl。实时分析在LightCycler 96系统（Roche）上进行。循环条件如下：1分钟在98°C；40个循环，每个循环10秒在98°C，15秒在60°C，以及35秒在68°C；随后进行熔解曲线分析。所有样本都进行了三次重复实验。在每个96孔PCR板中，包含了标准品的连续两倍稀释液以评估反应效率。长片段和短片段的扩增Ct平均值以及扩增效率被用于基于ΔΔCt的公式来计算每10 kb的DNA损伤数量（Lehle等人，2014年）。单个卵母细胞中的损伤数量是相对于表现出最低DNA损伤的对照卵母细胞计算的，该对照卵母细胞被假定为无损伤的。
海马分析
使用MitoStress Test试剂盒（Agilent，Santa Clara，美国）按照制造商的说明，并使用Seahorse XFp分析仪（Agilent）进行测试。在测试之前，培养基被更换为pH 7.4的Seahorse XF DMEM测试缓冲液，其中添加了2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸和10 mM葡萄糖。每个孔中加入总共180 µl的XF测试培养基，然后将卵母细胞从培养皿转移到平板中，并在无CO2的培养箱中孵育1小时。在加入寡霉素（1.5 µM）、羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯肼（FCCP；2 µM）和罗通宁及抗霉素A（Rot/AA，0.5 µM）后，测量氧气消耗率（OCR）。通过结合使用寡霉素（线粒体ATP合成酶（复合体V）的抑制剂）、FCCP（一种破坏质子梯度并干扰线粒体膜电位的解偶联剂）和Rot/AA（线粒体ETC复合体I和III的抑制剂），使用Agilent Seahorse分析仪实时测量GV期卵母细胞的氧气消耗率（OCR），从而评估线粒体功能的几个关键参数。数据使用Seahorse Wave软件（Seahorse Bioscience，Santa Clara，美国）进行分析，然后导出到Prism 8（GraphPad，La Jolla，CA，美国）进行统计分析。数据被标准化为每孔的卵母细胞数量。
纺锤体组装检查点（SAC）活性分析
经过3小时的减数分裂成熟培养后，通过选择那些已经经历GVBD的卵母细胞来同步它们。在额外的4小时培养后（总共7小时），将选定的卵母细胞转移到添加了AZ3146的培养基中，AZ3146是一种有效的SAC途径抑制剂（Daszkiewicz等人，2025年）。培养开始18小时后，根据减数分裂阶段对卵母细胞进行分类。
统计分析
所有实验至少进行了三次独立重复。正态分布通过Shapiro–Wilk检验进行分析，方差同质性通过Levene检验进行测试。数据以平均值±标准差（SD）表示。对于符合正态分布的两组数据之间的比较，使用Student’s t检验，而对于非正态分布的数据，则使用Mann-Whitney U检验。P < 0.05表示统计学上的显著差异（GraphPad软件，La Jolla，CA，美国）。
结果
PFAS暴露的GV期卵母细胞会导致核DNA损伤，改变线粒体活性，并影响GSH和ROS水平之间的平衡
GV期是卵巢中卵母细胞的未成熟、静止阶段。卵巢中含有有限数量的这些初级卵母细胞，它们位于静止的卵泡中。这些卵母细胞暴露于PFAS混合物后，与对照组相比，活性线粒体的水平增加了15%（p < 0.001；图2A）。同时，处理过的卵母细胞中还原型GSH含量显著升高（135% vs 对照组的100%；p < 0.01；图2C），伴随着活性氧（ROS）产生的减少21%（p < 0.01；图2B）。使用Seahorse XF分析仪测量线粒体功能显示，处理组的氧气消耗率（OCR）显著增加（p < 0.001；图2E），并且随时间的OCR曲线显示处理过的卵母细胞的最大呼吸作用增加（p < 0.001；图2F）。此外，DNA完整性分析显示，GV期卵母细胞暴露于Mix 24小时后，核DNA（nDNA）损伤数量显著增加（p < 0.05；图2G），然而对线粒体DNA（mtDNA）没有显著影响（图2H）。
图2
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
小鼠GV期卵母细胞在暴露于PFAS混合物24小时后的线粒体活性和呼吸作用、抗氧化系统、DNA损伤。Mix（PFOS 224 ng/mL，PFOA 145 ng/mL，PFHxS 213 ng/mL，PFDA 9 ng/mL，PFHpA 6 ng/mL，PFUnDA 4 ng/mL，PFNA 20 ng/mL）对线粒体活性（A）、ROS产生（B）、GSH水平（C）、基础OCR（E）以及OCR（F）、核DNA（G）和线粒体DNA损伤（H）的影响。代表性图像（D）显示了MitoTracker Deep Red染色（c, d），H2DCFDA标记（e, f），以及单氯联胺染色（i, j），指示线粒体活性（c, d）、ROS产生（e, f）和GSH水平（i, j）。误差条表示平均值±标准差（SD）；图上的每个点代表一个来自三个独立生物学重复的单独卵母细胞。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001 vs 对照组（C）。
PFAS混合物通过激活SAC阻碍小鼠卵母细胞的减数分裂成熟
接下来，我们分析了在体外成熟过程中暴露于Mix 18小时的卵母细胞的减数分裂成熟效率（实验2），以及在GV期连续暴露24小时后再进行18小时自发体外减数分裂成熟的卵母细胞（实验3）。PFAS混合物的暴露通过阻止第一极体（PB1）的排出，从而干扰了从胚泡破裂（GVBD）阶段到中期II（MII）阶段的过渡，破坏了卵母细胞的成熟。实际上，我们观察到在GVBD阶段停滞的卵母细胞比例显著增加（17.72% vs 7.72%，p < 0.05；图3A），同时达到MII阶段的卵母细胞比例减少（71% vs 81%，p < 0.05；图3A）。同样，在体外成熟过程中暴露24小时后再进行18小时体外减数分裂成熟后，停留在GVBD阶段的卵母细胞比例显著增加（20% vs 对照组的10%，p < 0.05；图3B），达到MII阶段的卵母细胞比例减少（73% vs 80%，p < 0.01；图3B）。PFAS处理后GVBD停滞频率增加的原因可能是SAC的激活，这是一种在基因组完整性受到威胁时阻止细胞周期进展的细胞机制。为了验证这种可能性，我们在存在PFAS混合物以及AZ3146（一种有效的SAC途径抑制剂）的条件下进行了卵母细胞成熟实验。在这些条件下，所有卵母细胞都排出了PB1并达到了MII阶段，而在仅存在PFAS的条件下，只有85%的卵母细胞完成了成熟（p < 0.05；图3B）。这些结果表明PFAS暴露激活了SAC，通过诱导卵母细胞在MI阶段停滞来阻止PB1的排出。
图3
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全尺寸图像
在体外暴露于PFAS的卵母细胞的减数分裂成熟过程。Mix（PFOS 224 ng/mL，PFOA 145 ng/mL，PFHxS 213 ng/mL，PFDA 9 ng/mL，PFHpA 6 ng/mL，PFUnDA 4 ng/mL，PFNA 20 ng/mL）对18小时暴露后的体外成熟效率（A）、在GV期暴露24小时后再进行18小时暴露后的效率（B），以及在PFAS和SAC抑制剂AZ3146同时处理下的效率（C）的影响。误差条表示平均值±标准差（SD）*P < 0.05，**P < 0.01 vs 对照组（C）。
在PFAS混合物存在下，减数分裂成熟受到阻碍
接下来，我们分析了在体外成熟过程中暴露于Mix 18小时的卵母细胞的减数分裂成熟效率（实验2），以及在GV期连续暴露24小时后再进行18小时自发体外减数分裂成熟的卵母细胞的效率（实验3）。PFAS混合物的暴露通过阻止第一极体（PB1）的排出，从而干扰了卵母细胞的成熟，影响了从胚泡破裂（GVBD）阶段到中期II（MII）阶段的过渡。实际上，我们观察到在体外成熟过程中暴露于PFAS的卵母细胞中有显著更高比例的卵母细胞停滞在GVBD阶段（17.72% vs 7.72%，p < 0.05；图3A），同时达到MII阶段的卵母细胞比例减少（71% vs 81%，p < 0.05；图3A）。同样，在体外成熟过程中暴露24小时后再进行18小时体外减数分裂成熟后，停留在GVBD阶段的卵母细胞比例显著增加（20% vs 对照组的10%，p < 0.05；图3B），达到MII阶段的卵母细胞比例减少（73% vs 80%，p < 0.01；图3B）。PFAS处理后GVBD停滞频率增加的原因可能是SAC的激活，这是一种在基因组完整性受到威胁时阻止细胞周期进展的细胞机制。为了验证这一可能性，我们在存在PFAS混合物以及AZ3146（一种有效的SAC途径抑制剂）的条件下进行了卵母细胞成熟实验。在这些条件下，所有卵母细胞都排出了PB1并达到了MII阶段，而在仅存在PFAS的条件下，只有85%的卵母细胞完成了成熟（p < 0.05；图3B）。这些结果表明PFAS暴露激活了SAC，通过诱导卵母细胞在MI阶段停滞来阻止PB1的排出。
图3
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
在体外暴露于PFAS的卵母细胞的减数分裂成熟过程。Mix（PFOS 224 ng/mL，PFOA 145 ng/mL，PFHxS 213 ng/mL，PFDA 9 ng/mL，PFHpA 6 ng/mL，PFUnDA 4 ng/mL，PFNA 20 ng/mL）对18小时暴露后的体外成熟效率（A）、在GV期暴露24小时后再进行18小时暴露后的效率（B），以及在PFAS和SAC抑制剂AZ3146同时处理下的效率（C）的影响。误差条表示平均值±标准差（SD）*P < 0.05，**P < 0.01 vs 对照组（C）。
在PFAS混合物存在下，减数分裂成熟完成会导致nDNA损伤，但对线粒体活性和ROS/GSH平衡没有影响
在减数分裂成熟过程中暴露于PFAS混合物的卵母细胞中有相当一部分在MI阶段停滞。然而，大多数卵母细胞仍完成了成熟，达到了MII阶段。因此，我们决定检查在PFAS存在下完全成熟到MII阶段的卵母细胞的状态。这些卵母细胞的线粒体活性、ROS产生以及GSH水平与对照组的MII期卵母细胞相当（图4A-D）。然而，nDNA损伤水平比对照组增加了40%（p < 0.05；图4E），而mtDNA损伤水平没有变化（图4F）。
图4
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
在PFAS存在下进行减数分裂成熟的鼠MII期卵母细胞的线粒体活性、ROS产生以及GSH和DNA损伤水平。Mix（PFOS 224 ng/mL，PFOA 145 ng/mL，PFHxS 213 ng/mL，PFDA 9 ng/mL，PFHpA 6 ng/mL，PFUnDA 4 ng/mL，PFNA 20 ng/mL）处理对线粒体活性（A）、ROS产生（B）、GSH水平（C）、核DNA（nDNA）（E）和线粒体DNA（mtDNA）损伤（F）的影响。代表性图像（D）显示了MitoTracker Deep Red染色（c, d），H2DCFDA标记（e, f），以及单氯联胺染色（i, j），指示线粒体活性（c, d）、ROS产生（e, f）和GSH水平（i, j）。误差条表示平均值±标准差（SD）。图表上的每个点代表一个卵母细胞，这些卵母细胞来自三个独立的生物学重复实验。*P < 0.05，与对照组（C）相比。将卵母细胞暴露于PFAS混合物24小时后，再进行18小时的体外减数分裂成熟处理，不会影响MII期小鼠卵母细胞的线粒体活性或ROS和GSH水平。由于在体外成熟过程中暴露于PFAS混合物18小时的MII期卵母细胞中未观察到线粒体活性或GSH和ROS水平的变化，因此尝试评估长时间暴露（在GV阶段暴露24小时，然后在体外成熟过程中再暴露18小时）的影响。尽管暴露时间延长，但未发现线粒体活性或细胞内GSH和ROS水平有统计学上的显著变化（图5A-C）。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了42小时暴露于PFAS混合物对小鼠MII期卵母细胞的线粒体活性和抗氧化系统的影响。处理后的卵母细胞在24小时+18小时后，其线粒体活性（A）、ROS生成（B）和GSH水平（C）的变化情况。代表性图像（D）包括MitoTracker Deep Red染色（c, d），显示线粒体活性；H2DCFDA标记（e, f），显示ROS生成；以及单氯联胺染色（i, j），显示GSH水平。误差条表示平均值±标准差（SD）。图表上的每个点代表一个卵母细胞，来自三个独立的生物学重复实验。
讨论
卵母细胞是极其敏感的细胞，其质量和发育能力取决于精确的代谢平衡、氧化还原平衡以及基因组完整性（Yuan等人2012；Li等人2020；Richani等人2021）。任何破坏这些过程的因素都可能导致卵母细胞成熟、受精和胚胎发育受损。因此，本研究的总体目的是确定一种与人类卵泡液（FF）中检测到的化合物在组成和浓度上相匹配的PFAS混合物（Kim等人2020；Bellavia等人2023；Boney等人2026）对卵母细胞减数分裂成熟、线粒体功能及DNA完整性的影响。我们的结果显示，PFAS混合物通过激活SAC（纺锤体组装中心）导致减数分裂在MI（中期）阶段停滞，从而减少了完成成熟的卵母细胞数量。此外，在GV（卵泡早期）阶段以及减数分裂成熟过程中暴露于PFAS会导致nDNA损伤。有趣的是，我们观察到PFAS诱导的线粒体活性升高，这破坏了GSH和ROS之间的平衡，但仅发生在GV阶段的卵母细胞中。
近年来，由于PFAS的稳定性和在体液（如卵泡液）中的存在，其对女性生殖细胞的潜在影响受到了越来越多的关注（Kim等人2020；Bian等人2025）。先前的研究报告了PFAS对哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟、ROS水平、线粒体功能和DNA完整性的有害影响（Chen等人2021；Jiao等人2021；Zhang等人2022；Feng等人2023）。然而，这些化合物通常是单独测试或在相对较高的剂量下测试的。同时，PFAS表现出复杂且依赖于背景的效果，包括非单调的剂量-反应关系，低浓度和高浓度可能引发不同的细胞反应。当单独测试化合物与混合物相比时，PFAS的生物活性也可能有所不同，这是由于加性、协同或拮抗作用。最近的一项研究部分解决了这些物质的这种不可预测性，该研究表明，在接近生理相关水平的剂量下同时体内暴露于PFOS和PFOA会在卵母细胞中引发一系列效应，包括我们在研究中观察到的效应，如减数分裂停滞、ROS水平和线粒体活性的变化以及DNA损伤（Yan等人2025）。因此，本研究的关键优势在于使用了非常复杂的PFAS混合物，其剂量和化合物比例反映了人类卵泡液中的测量值（Kim等人2020），从而提供了对PFAS相关风险对女性生殖能力的生理相关评估。
众所周知，减数分裂成熟的进程受到SAC（纺锤体组装中心）的监控，SAC负责确保染色体正确且稳定地附着在微管上（Lara-Gonzalez等人2012）。一旦附着建立，SAC就会沉默，使卵母细胞能够排出PB1并完成MII阶段的成熟。我们发现，暴露于PFAS的卵母细胞中有相当一部分没有排出PB1，然而同时抑制SAC通路可以恢复减数分裂的完成。这证明了PFAS诱导的PB1排出抑制是由SAC的激活引起的，从而导致卵母细胞在MI阶段停滞。在哺乳动物卵母细胞中，DNA损伤会触发SAC诱导MI停滞（Collins等人2015；Marangos等人2015），从而降低异常胚胎形成的风险。一致地，我们发现，在PFAS存在下成熟的卵母细胞表现出更高的DNA损伤频率。这强烈表明，在那些在MI阶段因PFAS而停滞的卵母细胞中，DNA损伤程度超过了SAC激活的阈值。据我们所知，目前还没有数据记录PFAS对SAC激活的影响。然而，与我们的发现一致，先前的研究表明，PFNA（Jiao等人2021）和PFOS与PFOA（Feng等人2023）会通过阻断MI到MII的过渡来阻碍小鼠卵母细胞的减数分裂成熟。根据我们的结果，SAC激活似乎是一种保护性反应，因为PFAS暴露在GV阶段就已经导致了nDNA损伤。然而，MII期卵母细胞中持续存在的DNA损伤引发了关于这些卵母细胞发育能力的严重担忧，尽管暴露于PFAS，它们仍能逃避SAC停滞并继续进行减数分裂。
有趣的是，我们观察到PFAS会提高GV阶段卵母细胞的线粒体活性和氧气消耗率，据我们所知，这一效应之前尚未被报道。线粒体是ROS的主要来源，它们在氧化代谢过程中产生ROS。另一方面，谷胱甘肽（GSH）作为主要的抗氧化剂，可以中和ROS以防止细胞损伤，维持氧化还原平衡，并支持正常的成熟、受精和早期胚胎发育（Hansen等人2015；Ren等人2025）。我们观察到PFAS增加了GSH水平并减少了ROS生成，尽管在GV阶段的卵母细胞中线粒体活性较高，但在MII阶段的卵母细胞中则没有这种变化。这一观察表明，未成熟的GV阶段卵母细胞对PFAS暴露更为敏感，这可能会破坏线粒体活性、ROS生成和GSH水平之间的微妙平衡。哺乳动物卵母细胞从胎儿期开始直到排卵，在GV阶段一直处于生理上的阻塞状态——在小鼠中持续数月，在人类中甚至持续数十年。鉴于PFAS能够穿过胎盘屏障并到达胎儿（Alteri等人2025），这意味着这些化合物可能对卵母细胞在卵子发生过程中最敏感的阶段产生长期影响。
重要的是，我们的数据揭示了卵母细胞对PFAS暴露的阶段特异性脆弱性。未成熟的GV阶段卵母细胞表现出线粒体活性和氧气消耗增加，伴随着氧化还原稳态的改变，表现为GSH水平升高和ROS降低。这种适应性反应表明卵母细胞试图对抗PFAS诱导的代谢压力，但同时也突显了这一早期阶段线粒体-氧化还原平衡的脆弱性。一个问题出现了：在自然条件下暴露于PFAS污染的卵母细胞在GV阶段的长时间生理停滞过程中，能在多大程度上（以及以何种代价）持续这种对抗机制。相比之下，尽管存在显著的DNA损伤，MII阶段卵母细胞在线粒体和氧化还原变化方面的反应似乎较弱，这突显了对胚胎质量和生育能力的潜在隐性风险。
总之，我们首次证明了与人类暴露相关的PFAS混合物浓度和组成会破坏卵母细胞的成熟、基因组完整性和线粒体功能。通过确定SAC激活和阶段依赖的代谢紊乱是PFAS毒性的关键靶点，我们的研究加深了对持久性环境污染物如何导致女性亚生育能力和不良生殖结果的理解。
研究数据存放
研究数据将在发表后存放在克拉科夫开放研究数据存储库（RODBUK）中。
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