亨特·J·克拉克 | 朱正贞 | 马克·尼茨
多伦多大学化学系，加拿大安大略省多伦多市
mark.nitz@utoronto.ca
磷酸酯的细胞内递送仍然是一个挑战，这通常需要使用前药策略。我们报道了一种响应蛋白酶的支架，该支架将酶催化的肽切割与甾体受阻酰基磷酸上的自发分子内内酰胺化联系起来，从而释放磷酸。这种设计代表了一种独特的磷酸释放机制，与基于膦酰胺的前药（ProTides）和其他酯酶触发系统有根本不同。使用苯丙氨酸基单烷基酰基磷酸作为模型底物，我们证明了该支架在温和条件下会经历胰凝乳蛋白酶依赖性的分解，释放含磷酸的底物。通过改进的Staudinger连接反应的模块化合成表明，可以生成其他蛋白酶识别序列。这一概念验证为通过酰基磷酸实现酶触发磷酸释放提供了一个通用平台，具有在前药开发和细胞内探针递送方面的潜在应用。
**引言**
含磷酸的小分子的细胞内递送仍然是一个挑战。磷酸酯的负电荷和高极性严重限制了其通过脂质膜的被动扩散，而转运蛋白介导的摄取通常是底物特异性的并且受到严格调控。因此，含磷酸的药物和探针通常生物利用度低，细胞内积累有限，这促使人们开发了多种磷酸掩蔽策略。在这些策略中（图1），ProTide被广泛采用。在这种设计中，磷酸被掩蔽为膦酰胺，从而增强了亲脂性并绕过了对转运蛋白介导的摄取的需求。一旦内化，前药会依次被酯酶（如Cathepsin A或CES1）和膦酰胺酶HinT1激活，最终释放磷酸化负载物。尽管这种方法在哺乳动物系统中用于核苷酸磷酸的递送非常有效，但由于同源水解酶及其底物特异性在不同物种和细胞类型之间存在显著差异，其应用范围受到限制。
**几种替代的磷酸掩蔽策略（图1）**也被探索过，包括非酶系统（如cycloSaligenyl（cycloSal））和依赖酯酶的acyloxymethyl或S-acyl-2-thioethyl方法。这些方法突显了磷酸保护的化学多样性，但强烈依赖于细胞内环境来触发激活。例如，cycloSal设计通过纯化学机制释放磷酸，无需酶的帮助。尽管概念上通用且适用于多种负载物，但cycloSal前药通常需要高浓度才能引发生物活性，并且通常比已建立的类似物效力较低。这种行为归因于有限的被动扩散和次优的稳定性——要么是过度持久性阻碍了细胞内释放，要么是在细胞外过早降解。相比之下，acyloxymethyl和S-acyl-2-thioethyl酯依赖于细胞内酯酶来释放磷酸，使其性能严重依赖于宿主酶的表达，因此在酯酶活性较低的系统中不太适用。总体而言，这些观察结果强调了继续需要能够在多种生物学环境中发挥作用的稳健且多功能的磷酸释放策略。
在这里，我们提出了一种响应蛋白酶的磷酸释放支架，它将酶催化的肽切割与自发分子内内酰胺化联系起来。酶触发的自毁释放在前药设计中已被广泛研究，其中酯酶或蛋白酶介导的切割会引发对氨基苄基氨基甲酸酯（PABC）间隔基团的分解，释放活性负载物。含磷酸的自毁连接剂也被描述过，它们可以同时释放两种负载物；然而，在这些系统中，磷酸仅作为短暂触发剂而不是递送的物种。Garbaccio及其同事同样展示了通过抗体-药物偶联物中的Cathepsin B激活的磷酸桥接PABC连接剂“CatPhos”，释放所需的负载物和活性叠氮醌甲烷。相比之下，我们的方法通过内酰胺形成从酰基磷酸中间体释放磷酸，生成惰性的内酰胺作为唯一的副产物。
**结果与讨论**
在这项研究开始时，我们试图评估酰基磷酸是否可以作为前药支架中的可行结构元素。酰基磷酸是天然存在的高能中间体，在代谢中起核心作用，以其内在的电亲和力以及参与酰基转移或磷酸转移反应的双重能力而著称。虽然这些性质奠定了它们的生物学效用，但也引发了关于在水性和亲核试剂丰富环境中化学稳定性的担忧。先前对甲基乙酰磷酸的研究表明，其在中性pH下的水解半衰期约为几天，但相关的氨基酰基磷酸在几分钟内就会水解。因此，确定能否降低酰基磷酸的反应性，以提供在自毁分解前足够稳定的分子非常重要。为此，我们合成了一系列在羰基α位具有不同取代基的酰基磷酸衍生物，研究空间效应和电子效应如何影响整体稳定性。
基于从相应酸酐一步制备的便利性，选择了化合物（图2）进行初步稳定性评估。这些化合物在伪一级条件下（pH 7.0，1 M MOPS）使用过量的赖氨酸（100 mM）作为代表性亲核试剂进行评估。选择高浓度的赖氨酸是为了模拟生物环境中存在的过量亲核试剂。酰基磷酸的氨基水解比水解更快，实验设计旨在优先探究氨基水解反应性。通过31P NMR光谱确定氨基水解速率，其中氨基水解产物的形成（δ ≈ −0.6 ppm）导致相对于母体酰基磷酸信号（δ ≈ −12 ppm）的明显向下位移，从而可以随时间监测反应进展。如图2所示，增加α碳上的甲基取代程度显著提高了酰基磷酸的稳定性。化合物的半衰期分别约为5分钟、27分钟、636分钟和66分钟。化合物和表现出相似的半衰期，增强的稳定性可能源于与芳基取代基相关的电子效应，这可能降低了羰基中心的电亲和力。化合物可以与苯甲酰甲基磷酸相比，其报道的氨基水解速率相差两倍。比较乙基和戊酰衍生物的氨基水解速率，观察到的两个数量级的降低与具有相同酰基取代基的对硝基苯酯的氨基水解差异一致。总体而言，这些结果表明，在生物学相关条件下，降解主要通过羰基中心的亲核攻击发生C–O键断裂，而通过α位的空间修饰可以显著减弱这一途径。
根据氨基水解研究的结果，目标模型化合物包含一个磷酸酯负载物、一个自毁连接剂和一个蛋白酶识别序列。在我们的系统中，选择了苯基磷酸（）和甲基磷酸（）作为模型磷酸酯负载物，因为它们在合成上易于获得，并且代表了生物学相关的有机磷酸酯。连接剂的设计需要其在酶激活前保持化学稳定，同时在蛋白酶切割后容易反应。在羰基-磷酸上引入α,α-二甲基取代基可以稳定未激活的前药，同时加速酰胺水解后的分子内环化，这与Thorpe–Ingold效应一致。众所周知，5元和6元内酰胺在适当的酯存在下会通过分子内环化自发形成。我们选择了六原子连接剂而不是五原子类似物，因为其合成可行性更好。苯丙氨酸被纳入我们的模型中作为蛋白酶识别序列，作为胰凝乳蛋白酶（CT）的底物；这种酶已被广泛研究，易于获得，并且对芳香族残基的羧基末端有强烈的切割偏好。此外，模块化合成设想首先将叠氮酸与所需的磷酸酯负载物偶联。然后叠氮基作为受保护的胺，进行后续的Staudinger连接反应（方案1）。通过碱性水解各自的市售二氯磷酸，可以容易地制备和。自毁连接剂的合成始于用1,3-二溴丙烷烷基化乙基异丁酸酯。随后用叠氮化钠进行亲核取代，然后皂化酯，产率约为86%。中间体转化为相应的酰氯，再与所需的烷基磷酸偶联，得到和。尽管通过偶联酸酐可以高效制备酰基磷酸，通常可以获得更高的产率和更纯净的产品谱，但这种方法由于α,α-二甲基取代基引起的空间阻碍而效果不佳。为了克服这个问题，采用了无痕Staudinger连接策略，直接从稳定的叠氮前体形成酰胺键。
通过监测胰凝乳蛋白酶（CT）（37 °C，100 mM HEPES pH 8，10 mM CaCl2）下的水解来评估自毁磷酸释放支架的性能。向反应混合物中添加Ca2+是为了确保CT的最佳稳定性和活性。据报道，二价金属离子可以加速酰基磷酸的水解，但需要高毫摩尔浓度的Ca2+才能产生显著效果。反应进展通过1H和31P NMR光谱（图3a和b）进行评估。成功的酰胺键断裂和分子内环化预计会释放苯基磷酸，其在31P NMR光谱中表现为相对于酰基磷酸起始材料的特征性向下位移。然而，在我们的实验条件下，苯基磷酸盐信号由于与胰凝乳蛋白酶结合的Ca2+离子的沉淀作用而减弱。为了确认苯基磷酸盐的释放，我们对反应混合物进行了HPLC分析，并观察到了与苯基磷酸盐释放一致的信号（图S1）。1H NMR光谱提供了反应进程的补充测量，因为底物中的非对映异构体gem-二甲基质子的信号合并为单峰，反映了相邻立体中心的丢失。下载：下载高分辨率图像（724KB）下载：下载全尺寸图像图3. (a) CT + (1M HEPES pH 8, 100 μM CT, 10 mM, 37 °C, 10 mM CaCl2)的1H NMR光谱；(b) 如(a)中所示的CT + 的31P NMR光谱；(c) 内酰胺添加实验。底部光谱代表原始反应混合物；顶部光谱代表添加了内酰胺的反应混合物。1H NMR光谱中6.3 ppm处的参考信号对应于马来酸内标（10 mM）。31P NMR光谱中30 ppm处的参考信号对应于甲基膦酸内标（10 mM）。NMR时间进程（图3a和b）显示起始的gem-二甲基双峰强度逐渐减弱，同时出现并增长一个新的低场单峰（1.47 ppm），这与转化为环化产物一致。通过向粗反应混合物中添加真实产物，证实了酰胺（3,3-二甲基哌啶-2-酮）的存在，这导致新形成的单峰信号强度增加（图3c），验证了我们提出的蛋白酶触发磷酸盐释放的机制。为了评估酶促反应，我们将实验初始速率（vo）与已建立的显色底物N-琥珀酰-L-苯丙氨酸-p-硝基苯胺（Suc-Phe-pNA）的速率进行了比较。这项分析表明，胰凝乳蛋白酶对CT的活性明显较慢，大约只有基准底物速率的10%，这与Phe-pNA是一种活化底物一致。有趣的是，没有观察到CT完全转化为其相应产物。通过延长反应时间和添加额外的酶，仅能实现50%的转化率（图S2）。对这些结果感兴趣，我们接下来评估了CT是否也是胰凝乳蛋白酶的抑制剂。使用显色底物Suc-Phe-pNA（2 mM, 50 mM HEPES pH 8, 5 mM CaCl2）监测了胰凝乳蛋白酶（10 μM）的活性，并逐渐增加CT的浓度（0.75–3.0 mM）。在抑制剂存在下，未观察到反应速率的显著降低（图S3）。这表明有限的转化率并非由于酶活性被抑制，而是由于底物的不均匀性。这些发现与N-乙酰苯丙氨酸在酯形成过程中的外消旋一致。为了验证这一点，将CT样品水解，并分析了释放出的氨基酸相对于真实N-乙酰-L-苯丙氨酸的光学旋转。水解后的物质没有表现出光学活性。尽管已知酰基化氨基酸在偶联过程中会以加速的速率外消旋，但之前没有报道过这些结构的制备过程中的外消旋现象，需要进一步的工作来优化这些酯的合成。为了探讨磷酸盐取代基的性质是否影响支架的稳定性或性能，我们制备了一种替代衍生物，其中苯基被较小的甲基取代基取代。该化合物的合成方法与CT类似，仅磷酸盐取代基不同。在相同的条件下（37 °C, pH 8 HEPES缓冲液）使用1H NMR光谱评估了其性能。除了上述预期的信号外，还可以通过观察烷基磷酸盐的甲基质子信号的变化（从起始材料的3.95 ppm变为产物的3.77 ppm）来检测磷酸盐的释放。然而，时间进程NMR分析（图4）未发现预期在1.47 ppm处出现的内酰胺。相反，观察到1.34 ppm处的双峰，表明苯丙氨酰酰胺保持完整，表明酰胺水解过程中酰基磷酸键的裂解缓慢。同时，3.77 ppm处的甲基磷酸峰随时间增加。氨基酸连接剂和甲基磷酸峰的出现速率平行，表明该化合物主要经历缓慢的非酶促水解（图4和图S4）。下载：下载高分辨率图像（648KB）下载：下载全尺寸图像图4. (a) CT + (1M HEPES pH 8, 100 μM CT, 10 mM, 37 °C, 10 mM CaCl2)的1H NMR光谱；突出显示的峰对应于上述方案中相同颜色的质子。(b) 在没有酶的情况下CT对CT的水解背景。CT和CT之间的对比结果强调了磷酸盐取代基对酶激活的影响。鉴于已知酰基磷酸盐是相关β-内酰胺酶的抑制剂，我们接下来试图确认观察到的不同结果不是由于胰凝乳蛋白酶的抑制作用。按照上述方法进行了对照活性测定。在最高评估浓度（3 mM）下，化合物没有显示出酶抑制的迹象（图S3）。确定CT没有表现出抑制作用后，CT和CT的不同反应性可以用底物识别来解释。胰凝乳蛋白酶的催化效率不仅由P1残基决定，还受到占据酶内互补位点的P4–P3′位置残基的贡献。在Schellenberger模型中，当每个片段与具有相应偏好的位点匹配时，底物亲和力和转化率都会提高。S1和S2′口袋都显著偏好疏水性取代基。在这个框架下，我们将苯丙氨酸残基放置在S1位置，免疫连接剂和磷酸盐取代基放置在P′位置。将苯基放置在适合疏水接触的位置可能有助于提高对该底物的识别和切割，而极性较强的甲基磷酸盐则可能无法被P′位点有效识别，从而导致切割效果差。尽管本研究中使用了胰凝乳蛋白酶作为模型蛋白酶，但该支架的模块化特性使得可以替换肽识别序列以针对不同的蛋白水解环境。例如，在植物系统中，类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶是很有吸引力的候选者，而在微生物或体外环境中，可以使用广泛活性的酶如蛋白酶K或枯草杆菌蛋白酶。更一般地说，根据目标蛋白酶的特异性定制末端肽序列应该可以使这种策略适应各种生物环境，以实现受控的磷酸盐释放。结论在这项工作中，我们描述了一种模块化、由蛋白酶激活的支架的设计和评估，用于实现受控的磷酸盐释放。将该支架分解为三个功能独立的组件，形成了一个灵活的结构，支持修改的同时限制了合成复杂性。引入α,α-二甲基取代的酰基磷酸连接剂是设计的关键，它在酶激活前提供了增强的化学稳定性，并促进了蛋白水解后的快速分子内环化。使用胰凝乳蛋白酶作为模型系统，我们展示了该支架能够高效地被酶切割并形成内酰胺，从而释放磷酸盐，且没有检测到水解副产物的积累。相比之下，类似物无法被有效酶激活，而是经历缓慢的非酶促水解，这突显了磷酸盐取代基在决定蛋白酶识别中的重要性。对照实验确认这些不同的结果不是由于酶抑制，而是反映了底物与胰凝乳蛋白酶结合的差异。总体而言，这些结果为肽酶触发的自免疫策略释放磷酸盐提供了概念验证，并定义了控制支架性能的关键结构-反应性关系。未来的工作将致力于将该平台扩展到更复杂的磷酸盐负载物和肽识别序列，目标是在生物学相关环境中实现选择性的、酶引导的磷酸化代谢物的递送。利益冲突没有需要声明的利益冲突。数据可用性所有化合物的NMR光谱、补充图表和合成方案已包含在补充信息（SI）中。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ob00405a。
