油用及食用型向日葵GRAS转录因子家族比较分析鉴定HaGRAS19为盐胁迫响应调控因子

摘要： 向日葵（Helianthus annuus L.）是一种对逆境具有较强耐受性的全球性重要油料作物。GRAS转录因子是植物发育和胁迫响应的关键调控因子。然而，对于在经济性状上存在差异的油用型和食用型向日葵，该家族的系统性比较分析尚属空白。为此，研究人员对这两个向日葵类型的基因组进行了全基因组比较分析，在各自的基因组中均鉴定出98个GRAS基因。系统发育分析定义了一个新的、向日葵特有的亚家族FDSLD，该亚家族由一个独特的保守基序界定。比较基因组学进一步揭示了基因组成的类型特异性差异。例如，油用型向日葵含有5个DELLA基因，而食用型则含有4个。进化速率分析表明，GRAS家族经历了强烈的纯化选择，凸显了其功能保守性。基于顺式作用元件（cis-regulatory element）分析，研究人员对可能参与激素和胁迫响应的GRAS基因的表达谱进行了分析。通过瞬时沉默实验进行的功能表征证明，HaGRAS19对盐胁迫适应至关重要。具体而言，它通过减少活性氧（ROS）积累和丙二醛（MDA）产生，来消除盐诱导的氧化损伤。机制上，研究人员鉴定出一个HaGRAS19-HaSnRK2.2/2.4.3调控模块。HaGRAS19直接结合到HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3的启动子上。这种结合激活了脱落酸（ABA）依赖性信号通路，这一结论得到下游标记基因（HaABI2、HaEM6和HaRD26）定量调控的支持。本研究首次为向日葵GRAS家族提供了全面的比较基因组学资源。此外，对这一新型调控模块的表征，既为理解胁迫适应的基础机制提供了新见解，也为培育抗逆向日葵品种提供了有前景的靶点。

论文解读：

一、研究背景、存在问题与研究目的

向日葵是重要的全球性油料作物，主要分为用于榨油的油用型和直接食用的食用型。它以其对环境胁迫（如盐分和干旱）的显著耐受性而闻名。然而，土壤盐渍化日益严重，对向日葵的种植和产量稳定性构成重大威胁。盐胁迫通过破坏渗透和离子稳态对植物造成严重的生理损伤，并显著抑制种子萌发和植株发育。植物已进化出关键的耐受机制，并激活复杂的信号网络，其中植物激素脱落酸（ABA）是启动系统性适应性响应的核心调控因子。在众多参与盐胁迫分子响应的转录因子家族中，GRAS转录因子在高等植物中通过调控生长、发育、信号转导及生物与非生物胁迫响应等多种过程，发挥着关键作用。尽管GRAS家族已在模式植物和主要作物中得到表征，但在形态和生理性状存在差异的油用型和食用型向日葵之间，仍缺乏系统的比较分析，这限制了我们理解驱动这两个谱系驯化与适应的GRAS家族进化动态和功能分化。为解决此知识空白，本研究旨在对两种已测序基因组中的GRAS基因家族进行针对性的比较分析，并深入研究胁迫响应GRAS成员的功能机制，最终为培育抗逆向日葵品种提供种质特异性的基因家族资源和功能验证的遗传模块。

二、主要关键技术方法

本研究主要运用了以下关键技术方法：

1. 1.
   基因组学与生物信息学分析：从Ensemble Plants下载油用型向日葵基因组序列，并从实验室新组装的食用型向日葵（SK1）基因组获取序列。通过整合隐马尔可夫模型（HMM）谱搜索和本地BLASTp（Basic Local Alignment Search Tool for proteins）的方法，在全基因组水平上鉴定向日葵GRAS基因家族成员。
2. 2.
   比较基因组与进化分析：使用MEGA X软件构建系统发育树，分析GRAS蛋白的进化关系。利用MEME套件和NCBI保守结构域数据库（CDD）分析保守基序和结构域。从PlantCARE数据库提取启动子区序列，鉴定顺式作用元件（CRE）。通过分析非同义替换率与同义替换率之比（Ka/Ks）来评估进化选择压力。
3. 3.
   表达谱分析：利用公共数据库和实验室RNA测序（RNA-Seq）数据，分析GRAS基因在不同组织、发育阶段以及盐胁迫和赤霉素（GA₃）处理下的表达模式。通过实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）对候选基因的表达进行验证。
4. 4.
   功能表征实验：采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，构建烟草脆裂病毒（TRV）载体沉默目标基因HaGRAS19，并在盐胁迫下进行表型和生理指标（如相对含水量、活性氧（ROS）染色、丙二醛（MDA）含量）分析，以验证其功能。
5. 5.
   分子互作验证：通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告基因（Dual-Luciferase）实验，验证HaGRAS19蛋白与下游靶基因（HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3）启动子的直接结合及转录激活活性。

三、研究结果

3.1. 向日葵GRAS家族的全基因组鉴定与系统发育分析

在油用型和食用型向日葵基因组中分别鉴定出98个非冗余的GRAS基因。系统发育树将228个GRAS蛋白（来自两种向日葵和拟南芥）分为11个不同的亚家族。研究首次定义了一个新的、向日葵特有的单系分支，命名为FDSLD亚家族，该亚家族包含8个GRAS蛋白，在两种向日葵类型中各有4个。这一发现表明GRAS基因家族在植物进化过程中发生了进一步的功能分化。

3.2. GRAS基因的比较基因组学分析

染色体定位分析显示，GRAS基因在两种向日葵的所有17条染色体上分布不均，但整体模式相似，也存在类型特异性差异。同线性（Synteny）分析揭示了两种向日葵基因组之间广泛的GRAS基因同线性，特别是在7、8、13号染色体上，表明这些区域在两种栽培类型的进化过程中具有高度的保守性。

3.3. HaGRAS和HaSKGRAS蛋白的基序与保守结构域

在98个HaGRAS和98个HaSKGRAS蛋白中分别鉴定了10个保守基序。大多数基序高度保守，但位于N端、通常与功能特异性相关的基序10在两种类型间存在显著差异，在油用型中高度保守（>95%），在食用型中保守性较低（~45%），这可能是导致GRAS基因功能分化的关键因素。C端区域高度保守。保守结构域数据库（CDD）分析确认所有基因均包含特征性的GRAS结构域，而关键的DELLA结构域仅在有限的保守亚集中被发现（油用型5个，食用型4个）。

3.4. GRAS基因启动子中顺式作用元件的预测

对启动子区顺式作用元件（CRE）的分析将元件分为三大功能组：激素响应、胁迫响应和发育相关。其中，激素响应元件占比最高（56.25%），其次是胁迫响应元件（35.34%）。与食用型相比，油用型向日葵的启动子中富集了更多与赤霉素、生长素、低温、干旱、缺氧、防御、胚乳表达和种子特异性调控相关的元件。这表明油用型向日葵可能在适应非生物胁迫方面具有更强的调控潜力。

3.5. GRAS基因的同线性分析与进化速率估计

同线性分析显示，152个HaGRAS基因与食用型向日葵基因组中的同源基因存在一一对应的同线性关系，表明它们是自两种类型分化以来被保留的核心直系同源基因。绝大多数GRAS基因在同种内和种间比较中，其非同义替换率与同义替换率之比（Ka/Ks）均显著小于1，表明该基因家族在整个向日葵进化过程中主要受到强烈的纯化选择，以维持蛋白质功能。

3.6. GRAS基因的时空表达谱

RNA测序（RNA-Seq）表达谱分析显示，大多数GRAS基因均有转录。多个基因表现出组织特异性表达模式。在油用型向日葵中，部分HaGRAS基因在根和茎组织中表达升高，而所有基因在花粉中表达量均较低。在食用型向日葵中，HaSKGRAS基因也表现出组织和阶段特异性表达模式，例如HaSKGRAS94等基因在花蕾期的初生根中特异性高表达。

3.7. 激素和非生物胁迫下HaGRAS基因表达的qRT-PCR分析

在100 μM GA₃处理下，不同HaGRAS基因表现出不同的时序表达模式，表明特定成员参与赤霉素的早期信号和适应性响应。在200 mM NaCl盐胁迫下，根据启动子特征筛选出的18个候选基因表现出不同的时序表达模式。其中，HaGRAS19在盐胁迫下表现出最显著和最快速的诱导表达，因此被选作进一步功能表征的对象。

3.8. 通过瞬时沉默实验验证HaGRAS19在盐胁迫耐受性中的功能

瞬时沉默HaGRAS19显著削弱了向日葵对盐胁迫的适应能力。与空载体对照相比，沉默植株在盐胁迫下表现出更严重的萎蔫、更快的水分流失、更高的活性氧（O^2-和H₂O₂）积累以及更高的膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量。这些结果证实HaGRAS19通过维持水分状态和增强氧化胁迫耐受性来调控向日葵的盐胁迫响应。

3.9. HaGRAS19通过直接靶向HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3启动子激活胁迫响应基因表达

酵母单杂交（Y1H）实验证明HaGRAS19直接结合到HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3的启动子上。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，HaGRAS19在体内能够转录激活这两个基因。功能分析表明，沉默HaGRAS19破坏了盐胁迫对HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3基因的诱导激活。同时，经典的ABA响应下游标记基因（HaABI2、HaEM6和HaRD26）的盐诱导转录在HaGRAS19沉默植株中也显著受损。这些发现支持了一个工作模型：HaGRAS19通过直接结合并激活HaSnRK2.2和HaSnRK2.4.3的转录，从而正向调控ABA信号通路的下游转录输出，以增强向日葵的盐胁迫响应。

四、讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，本研究发现向日葵GRAS家族规模（98个成员）大于拟南芥（32个），这与基因家族扩张常与植物基因组复杂性和适应性进化相关的假说一致。新发现的FDSLD亚家族（C端含有FDSLD基序）是本研究的一个关键新发现，其C端结构域的差异可能赋予了其特化的转录调控特性。两种向日葵类型间的比较揭示了GRAS基因家族的显著分化：N端基序10的序列变异可能通过改变分子识别特征（MoRF）的结合特异性，导致蛋白质互作网络和功能结果的差异；DELLA亚家族基因拷贝数的差异（油用型5个，食用型4个）可能与两者不同的生长习性（如食用型通常更高大）相关。启动子分析揭示了与赤霉素和脱落酸响应相关的顺式作用元件，表明GRAS基因在整合环