朱晓鹏|徐海燕|吴晓东|刘贵民|张继鹏|盖振兰州交通大学环境与市政工程学院，中国甘肃省兰州市730070摘要与永久冻土相关的微生物群落长期暴露在低温环境中，因此可能会经历功能限制。尽管气候变暖和永久冻土退化预计会增强碳和氮的分解，但这些过程仍可能受到微生物功能能力的限制。为了确定控制永久冻土土壤中碳-氮释放的功能限制因素，我们使用来自青藏高原高山草甸、高山草原和高山湿地草甸生态系统的土壤进行了为期71天的培养实验，并添加了低海拔土壤。我们量化了培养前后无机氮、溶解有机碳（DOC）和二氧化碳（CO2）的变化。氮的动态变化显示出明显的时间模式：NH4+–N在所有阶段都表现出一致的正启动效应，实验处理组的平均值比对照组高0.08 mg/kg，在第7天达到最大增加量0.21 mg/kg。NO3–N在培养中期显著积累，而NO2–N则表现出短暂上升后迅速下降的趋势。DOC浓度在整个培养过程中下降，从105–110 mg/kg降至中期的大约55 mg/kg，实验处理组的降低幅度略大于对照组（54 mg/kg），表明添加低海拔土壤后DOC的消耗加速。我们的发现表明，添加低海拔土壤可能缓解氮的限制，刺激微生物矿化，并促进碳释放和氮转化之间的阶段依赖性协调。最强的响应发生在深层土壤中，其中外源土壤的添加与更强的碳转化和氮矿化相关。总体而言，结果表明永久冻土土壤受到营养相关和功能限制的影响，而气候变暖导致的这些限制的缓解可能会加速深层永久冻土土壤中的碳和氮损失。1. 引言青藏高原的永久冻土区域储存了大量的土壤有机碳和氮，这些碳氮库的变化可能会反馈到气候系统中（Chen等人，2022年）。近几十年来，该地区的变暖速度超过了全球平均水平，广泛的永久冻土退化显著加速了永久冻土碳和氮储量的分解（Gao等人，2021年）。长期监测表明，高原永久冻土带的植被长期受到氮的限制（Högberg，1997年；Kou等人，2020年）。同样，土壤微生物群落也普遍受到营养可用性的限制（Camenzind等人，2018年）。来自酶化学计量、元素比例、功能基因丰度和施肥实验的综合证据进一步表明，无论是活动层还是永久冻土中的微生物群落，在广泛的空间尺度上都主要受到氮的限制，或者在氮和磷的共同限制下受到限制，这种限制在高山草原和永久冻土之间的生态过渡带尤为明显（Zhang等人，2023年）。在高山草甸中，气候变暖加剧了微生物对氮的需求，使微生物代谢从碳限制转向更强的氮限制，从而改变了与分解相关的酶分配策略（Cai等人，2024年）。总的来说，这些发现表明氮限制是控制青藏高原永久冻土生态系统碳循环的关键因素。除了由元素不平衡引起的化学计量限制外，长期冻结还会导致永久冻土微生物群落的功能丧失，从而进一步限制碳和氮的循环。在长期低温条件下存活的微生物群落经历了强烈的环境筛选，导致群落层面关键代谢功能的缺失或极度耗尽（Ernakovich等人，2022年）。将功能多样的外源微生物群落接种到永久冻土土壤中已经显示出，引入缺失的代谢能力可以立即激活硝化作用——之前几乎不存在——并显著增强二氧化碳的产生，这表明微生物功能限制本身是限制永久冻土碳-氮循环的关键机制（Monteux等人，2020a）。在青藏高原的永久冻土区域，功能基因和宏基因组分析进一步揭示了土地覆盖类型和土壤深度对碳和氮循环基因分布的显著调节：高山草原的地表土壤富含同化氮代谢基因，而高山湿地草甸的深层土壤则表现出更高的反硝化和氨化潜力，这种空间异质性与土壤湿度、pH值、C:N:P化学计量比和地下生物量密切相关（Fan等人，2025年）。此外，变暖和永久冻土融化显著改变了微生物群落组成和功能潜力，增加了与易分解碳和甲烷生成相关的基因丰度，从而加剧了碳排放通量（Tang等人，2023年）。总的来说，这些发现表明高海拔永久冻土生态系统不仅仅是“富碳但贫氮”的系统；相反，它们同时受到元素氮限制和功能基因限制的制约。启动效应被认为是连接外源输入、微生物代谢变化以及稳定土壤有机碳和氮库动员的关键过程。可用碳或氮的输入可以显著改变本地土壤有机物的微生物分解，导致正启动或负启动，其方向和幅度主要由微生物氮限制的程度决定（Hicks等人，2019年）。微生物氮限制被认为是调节启动对氮添加响应的主要因素，特别是深层土壤对氮可用性的启动效应更为敏感（Feng和Zhu，2021年）。除了氮供应本身外，启动响应还取决于微生物策略、群落组成以及微生物类群对氮富集的适应性（Cui等人，2024年）。在青藏高原的高山草甸中，启动效应通常从地表层向深层土壤减弱；然而，一旦被激发，深层土壤中单位底物的碳损失潜力与地表土壤相当（He等人，2025年）。长期的氮和磷添加实验进一步表明，营养富集可以显著改变高山草甸中启动的方向和幅度，并通过重构微生物网络结构和功能潜力来修改碳和氮循环途径（Qin等人，2024年）。尽管如此，大多数现有研究将微生物群落视为“固定背景”，主要关注通过添加可溶性底物或无机氮来调整营养供应，而很少关注微生物群落本身的功能限制以及如何通过外源土壤输入来缓解这些限制。在实际的永久冻土退化过程中，活动层的加深不仅改变了温度和湿度条件，还不可避免地涉及来自地表或低海拔土壤的微生物“迁移”，可能引入缺失的氮循环功能，如硝化、反硝化或有机氮矿化（Monteux等人，2020b）。这种功能基因的“互补”可能会改变氮转化途径，并可能减少与氮可用性相关的限制，同时重塑不同无机氮形式（NH4+、NO3−、NO2−）和溶解有机碳（DOC）之间的耦合。通过改变启动效应的方向和幅度，这些过程可能会影响深层稳定碳和氮库的动员程度。然而，目前来自青藏高原永久冻土地区的研究很少综合考虑氮限制、微生物功能限制和微生物迁移的共同影响来研究碳和氮分解动态。基于这一背景，本研究调查了三典型高山草甸生态系统（高山草原、高山草甸和高山湿地草甸）中的永久冻土土壤，使用含有功能多样微生物群落的低海拔永久冻土作为外源接种物，以模拟气候变暖下的永久冻土-活动层加深和微生物迁移。因此，我们假设引入低海拔永久冻土可能会在氮限制和微生物功能限制条件下改变氮转化，并将主导的碳-氮响应从碳驱动的分解转变为更协调的碳和氮释放。为了验证这一假设，我们在两个土壤深度（10–20 cm和40–50 cm）进行了受控培养，并持续监测NH4+、NO3−、NO2−、DOC和CO2的动态变化。本研究的目标是：（1）确定外源微生物接种如何在氮限制和功能限制条件下通过启动效应影响无机氮形式的时间动态；（2）评估一旦微生物限制得到缓解，碳和氮的释放模式是否从“碳主导的消费过程”转变为更协调的C–N响应。这项研究有助于更深入地理解青藏高原永久冻土融化引起的启动响应，阐明土壤碳循环的微生物调节机制，并为评估气候变化影响和改进地球系统模型提供科学见解。2. 材料与方法2.1. 研究区域概述研究区域和采样点如图1所示（90°36′E–103°24′E，31°06′N–35°42′N）。该地区的平均海拔范围为3,000至6,000米（Yu等人，2020年），年平均降水量为200–800毫米（Liang等人，2013年），年平均温度在–5.6至3.8°C之间（Xu等人，2016年）。主要的草原类型包括高山草原、高山草甸和高山湿地草甸（Lin等人，2024年）。这三种生态系统类型在植被结构上也有所不同：高山草原通常以相对稀疏和低矮的旱生植被为特征，高山草甸以密集的湿润草甸植被为特征，而高山湿地草甸则以与水分相关的草甸植被为特征，覆盖率和生物量相对较高。这些描述符在这里用作生态系统级别的植被背景，而不是特定地点的物种清单。土壤通常具有浅层剖面特征（Wei等人，2018年）。下载：下载高分辨率图像（782KB）下载：下载全尺寸图像图1. 研究区域位置和采样点分布。AWM代表高山湿地草甸；AM代表高山草甸；AS代表高山草原；GT表示供体土壤。2.2. 土壤和植物采样在这项研究中，从青藏高原三江源地区（4,200–5,000米）的三种典型高山草甸类型（高山草原、高山草甸和高山湿地草甸）收集了土壤样本。记录了每个采样点的纬度、经度和海拔（表1）。使用直接收割方法收集植物样本。在每个地点随机选择了三个植被条件相似的样地，并使用25厘米×25厘米的样方采集地上生物量。将样方内的所有地上植物材料剪下并放入标记的纸袋中。在收集地上生物量后，使用土壤钻取器从0–20厘米的土壤层中收集根系，将其放入标记的密封袋中，以便后续测定地上生物量（AGB）和地下生物量（BGB）。表1. 采样点信息。站点IDALT（米）经度纬度海拔（米）AGB（克/平方米）BGB（克/平方米）AS12.7592.7334.504,556.8134.243,824.02AS23.0295.7034.334,373.3130.213,742.56AS33.2898.1334.814,201.8828.223,441.52AS42.3197.8235.114,236.6336.443,395.14AM12.8891.9033.094,927.59118.442,592.63AM23.0295.1434.714,643.70122.652,756.13AM31.7596.5933.964,459.46123.982,714.22AM42.2197.5934.954,290.94108.562,345.28AWM13.1292.3334.094,725.34277.366,158.69AWM21.8694.0235.084,620.33286.086,459.56AWM31.6697.7234.164,474.26296.586,628.91AWM42.6599.5035.494,497.99284.356,349.72GT3.24101.6333.703,483.0556.754,125.36注：ALT表示活动层厚度，AS表示高山草原；AM表示高山草甸；AWM表示高山湿地草甸；GT表示供体土壤；ABG表示地上生物量；BGB表示地下生物量。GT站点属于季节性冻结地面区域。（Ran等人，2022年）表1共包括12个受体田点，每种高山草甸类型四个站点。表2. 供体土壤（GT站点）的物理化学性质站点IDTC（克/千克）TN（克/千克）SOC（克/千克）DOC（毫克/千克）NH4+（毫克/千克）NO3−（毫克/千克）NO2−（毫克/千克）GT77.085.5664.93130.290.1091.6240.022表3. 土壤样本的物理化学性质。站点ID深度（厘米）TC（克/千克）TN（克/千克）SOC（克/千克）DOC（毫克/千克）NH4+（毫克/千克）NO3−（毫克/千克）NO2−（毫克/千克）AS0−1046.0532.93030.35080.9740.5754.3300.21610−2036.8702.45821.90469.6720.4032.3360.07720−3034.2491.38012.34370.1400.1331.5240.02330−4030.4611.0078.43641.5120.2191.3260.01440−5023.9900.7214.27950.6090.2971.3670.014AM0−1064.6243.73446.28573.1240.4003.3120.08710−2040.7852.81827.646119.2650.1182.2610.04020−3037.5102.29823.32894.3490.1011.4770.01730−4028.6791.66216.67597.2470.0521.2980.01740−5021.0031.0428.80477.6200.0891.1890.011AWM0−1088.0445.35663.064155.7480.1981.4850.03210−2071.9064.73047.091135.0650.4441.0540.03820−3058.9133.93038.280132.1070.4621.2370.04130−4059.7553.66533.265103.6750.3071.2700.01740−5045.0302.09027.25791.9380.1231.3500.020注：AS表示高山草原；AM表示高山草甸；AWM表示高山湿地草甸；GT表示供体土壤；TC表示总碳含量；TN表示总氮含量；SOC表示土壤有机碳含量；DOC表示溶解有机碳含量。土壤样本的收集包括两个部分：（1）土壤采样面积为10米×10米，使用五点采样方法收集土壤样本。从三江源地区的三种高山草甸类型（高山湿地草甸、高山草甸和高山草原）的永久冻土区域收集土壤样本。从0–50厘米深度每隔10厘米采集一次样本，每个深度大约收集1,500克土壤，并分成三部分。1. 第一部分通过5毫米筛子去除砾石，放入聚乙烯袋中，在实验室中风干，然后通过100目筛子筛选以获得用于测定总碳（TC）、土壤有机碳（SOC）和总氮（TN）的细土。2. 第二部分新鲜保存在聚乙烯袋中，并用冰袋冷藏运输，用于测量铵（NH4+）、硝酸盐（NO3−）、亚硝酸盐（NO2−）和溶解有机碳（DOC）。3.第三部分用于培养实验，被放置在无菌采样袋中，并在与新鲜土壤相同的冷却条件下储存；实验室收到后立即开始培养。此外，还从三江源地区海拔约3500米的低海拔草地或未施肥的农田中采集了0-20厘米深度的土壤，作为微生物接种到不同受永久冻土影响的草地土壤中的供体土壤。与上述方法相同，供体土壤也被分成三部分。
2.3 实验室测量
2.3.1 培养
为了研究表层土壤和深层土壤之间的启动响应差异，使用来自两个不同深度（10-20厘米和40-50厘米）的土壤样本进行了培养实验。在培养之前，样品在5°C下解冻，通过筛分和混合进行均质化，并在11°C下预培养7天以激活微生物活性。预培养后，通过用供体土壤替换2.5%的土壤质量（每50克土壤替换1.25克）来准备培养瓶（处理组），以模拟永久冻土退化过程对土壤中微生物群落和氮循环的影响，而对照组则保持不变（2.5%的供体土壤替换量旨在引入外源微生物群落，同时尽量减少对受体土壤的物理化学干扰。这种低替换比例避免了碳和氮底物、水分条件以及土壤物理化学性质的显著变化，从而有助于识别生物（微生物）驱动的效应）。Monteux等人（2020）指出，每种土壤类型和深度都分为四个培养瓶，每个瓶子装有50克土壤。培养在清洁但非无菌的条件下进行，以确保与其他生物地球化学培养研究的可比性（Knoblauch等人，2013；Wild等人，2016；Walz等人，2017）。所有培养瓶在11°C的有氧条件下培养71天，期间持续调整并维持水分。在前45天内至少每周测量一次培养瓶顶空中的CO2浓度，之后每月至少测量一次。
CO2产生率（τ）的计算公式如下：
(1)
其中Δt_i是两次测量之间的时间间隔，Pi是测量时的大气压力，V是培养瓶的顶空体积，R是理想气体常数，Ti是测量时的温度。
溶解无机氮（DIN）的计算公式如下：
(2)
启动效应（PE）的计算公式如下：
(3)
其中P_E和P_C分别代表实验组和对照组。PE > 0表示正的启动效应，意味着接种促进了土壤有机氮的净矿化和释放；PE < 0表示负的启动效应。
2.3.2 分析方法
植物样本在65°C下烘干至恒定重量后称重。土壤样本在室内风干、研磨并通过100目筛子筛选，以测定总有机碳（TOC）和总氮（TN）。TOC和DOC使用Elementar Vario TOC分析仪（Elementar Vario EL，德国汉诺威）通过高温燃烧法测定，而TN则使用Foss-8400自动Kjeldahl分析仪通过半微量Kjeldahl法测定。CO2浓度使用SBA-5 CO2气体分析仪测定。
2.4 数据分析
所有统计分析均在R软件中进行。对于NH4+、NO3−、NO2−和DOC，使用四因素ANOVA来测试处理、土壤深度、草地类型和培养时间的主效应及其交互效应。培养时间被视为一个分类因素。使用III型平方和来评估每个主效应和交互项的显著性。使用Tukey's HSD检验在每种草地类型×深度×时间组合内的处理组之间进行事后多重比较。使用Pearson双尾相关检验来研究土壤物理化学性质与环境变量之间的关系。此外，定量比较了不同草地类型、土壤深度、处理和培养阶段的CO2产生数据，并检查其与DIN启动效应的时间对应关系，以评估培养过程中的C-N响应协调性。为了评估供体土壤物理化学输入的潜在贡献，我们使用2.5%的供体土壤替换比例和供体及受体土壤的初始物理化学性质估算了每种处理的直接底物添加的理论上限。此外，我们还研究了DOC、CO2产生和无机氮形式之间的时间关联，以评估DOC动态是否与培养过程中的微生物呼吸和氮转化同步。数据处理、统计分析和可视化均在R软件中进行。补充图7-9中显示的统计显著性直接在图中用显著性符号或分组字母标注，这些注释的含义在相应的图例中解释。对于PE分析，PE值使用土壤深度、草地类型和培养时间作为解释因素进行统计评估，因为处理已经作为处理组和对照组之间的DIN差异纳入PE指标中。使用因子ANOVA来测试PE在土壤深度、草地类型和培养阶段之间是否有显著差异。
3. 结果
所有三种草地类型在早期都表现出相对较高的NH4+浓度，随后随时间逐渐下降，尽管不同生态系统类型的浓度范围有显著差异（图2）。在高山草地上，第7天时，对照组10-20厘米深度的NH4+浓度为0.56 mg/kg，40-50厘米深度为0.12 mg/kg。在实验组中，10-20厘米深度为1.61 mg/kg，40-50厘米深度为0.06 mg/kg。第15天时，对照组和实验组的表层浓度分别降至0.19 mg/kg和0.18 mg/kg，而深层浓度分别降至0.07 mg/kg和0.13 mg/kg。第31天时，浓度略有上升，对照组和实验组的表层浓度分别升至0.44 mg/kg和0.53 mg/kg，深层浓度分别升至0.72 mg/kg和0.21 mg/kg。第71天时，表层浓度降至0.05 mg/kg和0.08 mg/kg，深层浓度降至0.03 mg/kg和0.06 mg/kg，显示出稳定的下降趋势。在高山草甸上，NH4+浓度通常低于高山草地。第7天时，对照组和实验组的表层浓度分别为0.51 mg/kg和0.54 mg/kg，深层浓度分别为0.18 mg/kg和0.21 mg/kg。第15天时，表层浓度分别降至0.16 mg/kg和0.24 mg/kg，深层浓度分别为0.19 mg/kg和0.2 mg/kg。第31天时，表层浓度升至0.22 mg/kg和0.28 mg/kg，而对照组深层继续下降，实验组深层浓度升至0.28 mg/kg。第71天时，两者之间的差异保持较小。在高山湿地草地上，NH4+浓度最低，其变化趋势与高山草地相似。观察到一个一致的空间梯度，NH4+浓度顺序为：高山草原 > 高山草甸 > 高山湿地草地。
PE在草地类型、培养阶段及其与土壤深度的交互作用中表现出显著变化（表6和表7）。这些结果表明，PE高度依赖于具体环境，不能简单地概括为所有深层土壤中普遍存在的显著正启动效应。四因素ANOVA显示处理、土壤深度、草地类型和培养时间对NH4+、NO3−、NO2−和DOC动态有显著的主效应（表4）。对于NH4+，所有四个主效应均显著，大多数交互项也显著，除了处理×草地类型的交互作用。对于NO3−，主效应和大多数交互项均显著，尽管处理×深度×时间的交互作用不显著。对于NO2−，所有四个主效应均显著，而处理×深度的交互作用不显著。对于DOC，模型中包含的所有主效应和交互项均显著。这些结果表明，无机氮和溶解有机碳的响应受到处理、土壤深度、草地类型和培养时间的共同调节，而不仅仅是由单一因素决定的。
CO2产生率在所有草地类型和土壤深度中随培养时间的推移显著下降，表明易分解的底物迅速耗尽，呼吸活动逐渐减弱。总体而言，表层土壤的CO2产生量高于深层土壤，且下降幅度和速率在高山草原、高山草甸和高山湿地草地之间有所不同（图8）。统计分析进一步显示，CO2动态随培养阶段和土壤类型显著变化。与DIN启动效应的时间模式相比，早期较高的CO2释放与氮转化的较强变化大致一致，而后期培养阶段的呼吸活动较弱，时间对应关系较弱。这些结果表明，碳释放和氮矿化在培养过程中表现出阶段依赖的协调响应，尽管当前设计不允许直接归因于因果关系。
如图3所示，硝酸盐氮（NO3−）在三种草地类型中表现出明显的阶段特异性时间模式，尽管绝对浓度略有差异，但在两个深度（10-20厘米和40-50厘米）之间趋势一致。在高山草原（AS）和高山草甸（AM）中，7-15天时NO3−浓度相对较高，随后在31天时显著下降，形成明显的低谷，然后在第71天再次上升，呈现出典型的“下降-回升”U形模式。两个深度的轨迹几乎平行，表明时间响应相似，两个深度在第71天均有所增加。相比之下，高山湿地草地（AWM）表现出“上升-下降”模式：NO3−浓度在第15天达到峰值，然后在第31天和第71天持续下降。总体而言，AWM的NO3−水平显著低于AS和AM，且两个深度之间的差异相对较小，尽管两者都随时间呈现持续下降趋势。AS和AM在第31天达到共同的低点，随后在第71天恢复，而AWM在第15天达到峰值后持续下降。
如图4所示，亚硝酸盐氮（NO2−）的时间动态在三种草地类型中差异显著，7天、15天、31天和71天的波动模式不一致，浅层（10-20厘米）和深层（40-50厘米）土壤层之间的行为有时不同。在高山草原（AS）中，7天时NO2−浓度相对较高，15天时急剧下降，31天时略有回升，然后在71天再次下降。两个深度的轨迹几乎平行，表明时间响应相似，两个深度在第71天均有所增加。相比之下，高山湿地草地（AWM）表现出“上升-下降”模式：NO3−浓度在第15天达到峰值，然后在第31天和第71天持续下降。总体而言，AWM的NO3−水平显著低于AS和AM，且两个深度之间的差异相对较小，尽管两者都随时间呈现持续下降趋势。AS和AM在第31天达到共同的低点，随后在第71天恢复，而AWM在第15天达到峰值后持续下降。
如图4所示，三种草地类型中亚硝酸盐氮（NO2−）的时间动态差异显著，7天、15天、31天和71天的波动模式不一致，浅层（10-20厘米）和深层（40-50厘米）土壤层之间的行为有时不同。在高山草原（AS）中，7天时NO2−浓度相对较高，15天时急剧下降，31天时略有回升，然后在71天再次下降。两个深度都遵循“下降-增加-下降”的轨迹，尽管浅层的波动幅度更大。在高山草甸（AM）中，时间变化集中在早期：NO2−在7天达到峰值，15天时显著下降，31天和71天时保持较低且相对稳定，形成“早期峰值后稳定”的模式。31天后，浅层和深层趋于一致，此后差异较小。在高山湿地草地（AWM）中，7天到15天NO2−变化不大，但31天后开始明显分化。总体而言，AS和AM在早期表现出快速的NO2−浓度变化，而AWM在中后期表现出更明显的变化。在培养过程中，实验组和对照组之间的NO2−含量变化（数值为每种处理×深度组合的四个培养瓶的平均值±标准差）。如图5和图6所示，DOC与无机氮之间的关系在不同草地类型和处理之间存在差异，但这些差异应从特定处理的回归结果来解释，而不仅仅是基于汇总的视觉点分布。补充表8中提供的特定处理回归总结表明，在所有草地类型中，无论是对照组还是接种处理，DOC–NH4+的关系通常都较弱且不显著。相比之下，DOC–NO3−的关系仅在某些草地类型中显示出处理依赖性显著性，而不是在所有生态系统中都表现出一致的反应。这些结果表明，接种并没有产生普遍更强或更弱的DOC–N耦合模式，而是以环境依赖的方式修改了这种关系。
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图5. 培养过程中DOC与NH4+的关系（数值为每种处理×深度组合的四个培养瓶的平均值±标准差）。
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图6. 培养过程中DOC与NO3-的关系（数值为每种处理×深度组合的四个培养瓶的平均值±标准差）。
4. 讨论
4.1. 不同草地类型在培养过程中无机氮动态的差异
本研究比较了高山草原、高山草甸和高山湿地草甸生态系统中的NH4+、NO3−和NO2−的时间动态，揭示了明显的时间依赖性和生态系统特异性差异。这三种氮化合物都表现出与青藏高原永久冻土区独特环境条件密切相关的明显时间变化。总体而言，NH4+在培养初期迅速积累，随后下降，而NO3−在不同草地类型之间表现出强烈的空间差异。相比之下，NO2−保持在较低的背景水平，并且时间波动相对较小。这些模式反映了冻融驱动的微生物氮循环、植物氮吸收策略的差异以及土壤基质性质对多种氮转化途径的调节作用。
通过引入低海拔永久冻土作为永久冻土退化的类比，本研究揭示了土壤无机氮的复杂时间动态，其特征是NH4+积累延迟以及NO3−和NO2−在早期到中期的快速产生。这种时间上的不同步性与永久冻土扰动后氮转化过程的变化和化学计量约束的变化一致。在培养初期，添加的低海拔土壤可能引入了易利用的碳源（DOC），这可能增加了微生物对氮的需求，并促进了NH4+的固定或明显的负启动效应。因此，在第7-15天观察到的表层土壤中NH4+的抑制可能反映了在高营养需求条件下的更强微生物吸收或无机氮的固定。随着培养的进行和易分解碳的减少，后期NH4+的增加可能表明有机氮的净矿化作用增强。然而，由于本研究没有直接量化微生物生物量、胞外酶活性和氮循环功能基因，这些解释应被视为可能的机制，而不是特定微生物策略的直接证据。
与NH4+的延迟积累形成鲜明对比的是，NO3−在高山草甸和湿地草甸土壤中在中期（7-31天）表现出快速增加，表明硝化作用（NH4+ → NO2− → NO3−）迅速激活。这种早期NO3−的增加表明硝化微生物群落对启动输入的反应比有机氮矿化的净效应更快（Dijkstra和Keitel，2024）。在氧气通常有限的湿地草甸土壤中，第7天到第31天NO3−的显著增加可能反映了引入低海拔永久冻土或接种适应氧化还原条件变化的硝化菌群后通气情况的改善（Wu等人，2024）。NO2−的上升和下降模式进一步揭示了硝化途径的暂时性不平衡（Yoon等人，2015）。NO2−的早期积累是由于氨氧化速率超过亚硝酸盐氧化速率，形成了短暂的亚硝酸盐瓶颈（Su等人，2023）。在后期（31-71天），草原和湿地草甸表层土壤中NO2−的快速下降反映了亚硝酸盐氧化微生物的适应以及由于有机物分解和氧气消耗加剧而导致的厌氧条件的开始（Hall和Silver，2013；Roulet等人，2025）。在这种条件下，反硝化作用被刺激，导致NO2−迅速转化为气态氮（Wrage等人，2001）。这种广泛的NO2−暂时积累清楚地表明了氮循环的紊乱，并预示着在田间条件下N2O排放的风险增加，从而加剧了永久冻土融化和气候变暖之间的正反馈（Zhao等人，2024）。
尽管在某些后期培养阶段深层土壤中的PE（可能是指某种氮转化产物）趋于更强，但统计分析表明这种模式并非在所有生态系统中都普遍存在。相反，深层土壤中的PE反应强烈依赖于草地类型和培养阶段。引入供体土壤通过提供外部微生物和有机物间接模拟了活动层加深后有机氮库激活的潜在机制。然而，它并没有模拟与活动层加深相关的物理和热过程。在深层观察到的强烈激活——特别是在第31天到第71天之间高山湿地草甸中NH4+浓度的显著增加——突显了该生态系统中氮释放的显著潜在延迟。深层土壤在后期更强的反应可能与它们相对于表层土壤较低的初始底物和养分可用性有关。在所有三种草地类型中，40-50厘米深的土壤的TC（总碳）、TN（总氮）和SOC（有机碳）明显低于10-20厘米深的土壤，表明这些环境中的资源更为有限。在这种条件下，深层土壤中的微生物活动可能受到氮可用性和功能能力的更强限制（Piotrowska-Długosz等人，2022）。因此，当外源全土壤输入部分缓解了这些限制时，深层土壤可能表现出更大的矿化强度和正启动效应。这一解释也与先前的研究一致，即深层土壤对养分诱导的启动更为敏感，并且一旦被激活，可以动员稳定的碳和氮库。
4.2. 启动效应下无机氮与DOC关系的差异
本研究发现，草地生态系统中的净DOC消耗和净氮矿化（特别是NH4+和NO2−）在不同时间阶段存在显著差异。此外，DOC与无机氮形式（NH4+、NO2−）之间的关系受到处理方法、草地类型和培养期的综合影响，表现出随时间的变化。总体而言，接种土壤在第7天的DOC消耗和氮矿化作用更强。CO2数据也显示出类似的时间依赖性模式，即在培养初期呼吸作用较强，随后随时间显著下降。这表明培养的初始阶段以更活跃的碳周转为特征，这与无机氮和PE的更强变化大致一致。因此，本研究中的CO2产生最好解释为呼吸碳释放和整体微生物代谢强度的代理指标，支持碳释放和氮矿化之间的时间协调响应，而不是单一机制路径的直接证据。然而，在15-31天期间，DOC动态与氮转化之间的耦合在所有草地类型和处理组中并没有显著减弱，尽管某些草地类型和深度的变化趋势有所不同。这些模式反映了高山土壤中冻融扰动后微生物代谢策略的阶段特异性调整，与先前关于冻融生态系统中碳-氮耦合机制的研究结果一致（Zhang等人，2025）。然而，当前实验没有区分DOC的来源，因此无法确定DOC主要来自直接供体土壤输入还是来自受体土壤中本土有机物的分解和动员。根据2.5%的供体土壤替代比例和供体及受体土壤的初始DOC含量，供体土壤直接DOC输入的理论上限是有限的，表明仅靠供体土壤添加DOC不太可能完全解释培养期间观察到的DOC动态。在这种情况下，CO2产生仅被解释为整体微生物呼吸强度的指标，而不是DOC调节微生物氮转化的直接证据。在培养初期（第7天），DOC的加速消耗和NH4+的增强释放与细胞内化合物的释放、可溶性有机物的增加以及微生物的“脉冲矿化”密切相关（Andersson等人，2000）。在这个阶段，微生物优先利用易分解的碳底物，同时促进了同化和分解过程的增加，这解释了明显的DOC差异和高净氮矿化率。本研究第7天的发现与Chen等人（2022）的报告一致，他们报告了青藏高原上冻融扰动后的氮矿化增强，并进一步支持“冻融脉冲”理论——即土壤的初始激活阶段是碳-氮耦合最强的时期（Han等人，2020；Chen等人，2022）。随着培养的进行，DOC与氮矿化之间的关系减弱。几种机制可以解释这种变化：（1）易分解DOC的消耗，使微生物转向维持代谢并减少碳驱动的矿化（Brantley等人，2017）；（2）微生物NH4+吸收的增加，减少了净矿化效应（Min等人，2011）；（3）硝化作用的增强，将NH4+转化为NO2−和NO3−，从而削弱了氮转化与DOC之间的联系（Weyhenmeyer和Jeppesen，2010）。最近的研究还表明，随着易分解碳的减少，微生物对碳的限制加剧，导致氮转化过程较少依赖于DOC（Li等人，2022）。本研究第15天和第31天的结果与这些机制高度一致。
NH4+与DOC之间的关系在不同草地类型之间存在显著差异。尽管初步分析表明不同草地类型之间存在一些相关性，但回归分析显示，大多数草地类型和土壤层之间的DOC和NH4+浓度变化没有显著相关性（p ≥ 0.05）。仅在高山湿地草甸的10-20厘米土壤层中观察到两者之间的边际效应（p = 0.05）。这种对比表明，土壤湿度和氧气扩散等环境因素强烈影响氮转化途径。相对通风良好的草原土壤有利于矿化作用的增强，而湿地草甸中的高地下水位可能促进反硝化作用或微生物氮的固定，导致NH4+浓度随DOC的增加而下降。这些模式与Crowther等人（2019）的研究一致，他们强调了水分条件在调节氮周转率中的主导作用。相比之下，所有草地类型中NO3−与DOC之间的关系总体稳定且呈正相关，表明硝化通量相对于DOC波动较为稳定，并且更多地受到微生物群落组成和氧气可用性的控制，而不是DOC本身。最近的研究表明，氨氧化细菌和古菌（AOB/AOA）的丰度与土壤氧气供应密切相关，而DOC对硝化作用的直接影响较小（Jia等人，2021）。此外，接种削弱了生态系统中的DOC–无机氮关系，表明外源微生物可能由于竞争或本土微生物群落施加的资源限制而对高山土壤中的C–N周转影响有限。这与Lou等人（2022）的研究一致，他们提出高海拔土壤中强烈的微生物功能冗余限制了引入类群的定殖。特定处理的回归总结（补充表8）进一步表明，在两种处理中DOC–NH4+耦合通常较弱，而DOC–NO3−耦合仅在某些草地类型中显示出处理依赖性显著性。因此，接种对DOC–N耦合的影响应被视为环境依赖的，而不是在所有生态系统中都统一的。回归分析显示，在不同草地类型或土壤深度之间没有显著的DOC–NH4+–N关系（p ≥ 0.05），仅在高山湿地草甸的10-20厘米深度处检测到边际效应（p = 0.05）。这表明在这种实验条件下，NH4+–N动态并非由DOC的可用性线性驱动，而是可能由多种过程共同调节——包括微生物吸收、矿化和硝化作用——而不仅仅是单一的DOC依赖机制。相比之下，DOC与NO3–N之间的耦合仅在40–50厘米深度的高山草原中具有显著性（p = 0.033），而在其他土壤层或草地类型中则没有显著关系。这表明NO3–N对DOC的敏感性存在空间差异：较深的土壤具有更简单且对DOC响应更强的硝化途径，而表层土壤和湿地草甸则发生更复杂的氮转化过程（如反硝化作用、微生物固氮作用），这些过程削弱了DOC对NO3–动态的解释能力。本研究的一个主要局限性在于，通过添加整块土壤来模拟微生物迁移，未能完全区分微生物群落变化与土壤物理化学性质变化的影响。因此，观察到的“启动效应”实际上是这两种因素共同作用的结果。未来的研究可以采用诸如灭菌土壤接种或底物同位素标记等方法，以更精确地分析微生物功能限制和土壤基质限制在调节永久冻土碳氮循环中的相对贡献。
本研究的一个主要局限性在于，由于添加了整块土壤来模拟微生物迁移，未能完全区分微生物群落变化与供体土壤物理化学性质变化的影响。因此，观察到的“启动效应”应被视为这两种因素共同作用的结果。然而，根据2.5%的供体土壤替换比例以及供体和受体土壤的初始物理化学性质，我们估计了直接底物输入的理论上限，并发现供体土壤物理化学添加的量是有限的，对于某些变量来说，不足以完全解释观察到的碳氮动态变化。这表明仅靠供体土壤基质效应本身不太可能解释全部现象，尽管在当前的设计下也不能排除其贡献。此外，由于在本次实验中没有追踪DOC的来源，我们无法区分来自供体土壤的直接DOC输入与受体土壤中通过分解或本土有机物 mobilization 释放的DOC。尽管理论上限分析表明直接供体土壤DOC输入是有限的，但当前的设计仍无法明确区分观察到的DOC动态是由底物输入还是原位有机物周转引起的。未来的研究可以采用灭菌供体土壤接种、微生物细胞提取或底物同位素标记等方法，以更精确地解析微生物功能限制和供体土壤基质效应在调节永久冻土碳氮循环中的相对贡献。
**5. 结论**
本研究选取了青藏高原三江源地区三种典型的高山草地土壤，通过室内培养实验进行了研究，实验中添加了低海拔土壤以模拟气候变暖条件下的活动层加深和微生物迁移过程。这种方法有助于系统评估碳氮循环的功能限制及其在永久冻土退化过程中的缓解机制。研究结果显示无机氮具有明显的时间动态变化：NH4+ 通常表现出延迟积累的“启动效应”，NO3– 在中期迅速增加，而NO2– 则呈现短暂上升-下降的趋势，表明硝化途径暂时受阻，后期可能增强了反硝化作用。DOC含量随时间持续下降，尤其是在接种了低海拔土壤的样本中下降更为明显，这反映了微生物对外源碳的消耗增加以及更稳定有机物的 mobilization。总体而言，低海拔土壤的引入补充或增强了关键的氮循环功能，可能缓解了微生物对氮的限制，促使碳的利用方式从早期微生物同化转向后期酶介导的矿化过程。这些模式表明，在培养过程中碳释放和氮矿化之间存在阶段依赖的协调关系。这种效应在较深的土壤中最为显著。观察到的响应应被视为外源整块土壤输入的综合效应，其中微生物引入可能发挥了重要作用，但在当前的设计下无法完全将其与供体土壤基质效应区分开来。这些发现表明，持续的升温可能会通过缓解微生物功能限制和氮限制来加剧永久冻土土壤中的碳氮损失，这对高山生态系统的碳汇稳定性和气候反馈具有重要的意义。
**作者贡献声明**
徐海燕：撰写、审稿与编辑、验证、资源管理、方法论设计、资金获取、概念构思。
吴晓东：撰写、审稿与编辑、验证、监督、资源管理、资金获取、概念构思。
刘贵民：资源支持。
张继鹏：实验实施。
盖振：实验协助。
朱晓鹏：撰写初稿、数据可视化、软件应用、方法论设计、数据分析、数据管理。
**未引用的参考文献**
Chen et al., 2014; Hallama et al., 2021; Koponen et al., 2006; Purswani and Llorente, 2021; Ran et al., 2021; Wang and Kuzyakov, 2024.
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