高分辨率三维成像对于解析生物组织的多尺度结构至关重要。然而，传统工作流程将组织透明化与分子标记视为独立步骤，导致试剂传输与探针结合之间存在动力学失配，从而限制了成像深度、标记均匀性及通量。在此，研究人员提出 SynClear，这是一种通过将荧光探针嵌入化学工程化的透明化介质中，实现核标记与组织透明化同步进行的一步法策略。该集成配方能够在毫米级样本中实现快速且均匀的标记，同时保留内源性荧光并兼容多重免疫染色。研究人员证明了 SynClear 在多种组织类型中的广泛适用性，包括小鼠脑、外周器官及死后人脑皮层。在小鼠脑切片中，SynClear 支持精确的三维图谱注册和细胞构筑定量映射。在胶质母细胞瘤模型中，该方法解析了从肿瘤边界到免疫微环境的跨尺度病理特征。在人脑皮层中，它实现了分层解析的结构分析和神经元亚型映射。通过在单一化学框架内耦合标记与透明化过程，SynClear 为容积组织成像提供了一个稳健且可扩展的平台，在基础神经科学和转化病理学中具有潜在应用价值。
**SynClear：革新多尺度三维脑图谱绘制的同步透明化与标记策略**
**研究背景与意义**
解析大脑的多尺度组织结构需要能够保持从细胞到组织层面空间连续性的成像策略。光学组织透明化技术通过减少光散射和折射率不匹配，已成为深层三维成像的有力工具。现有的透明化方法主要分为溶剂型、水溶型和基于水凝胶的系统，尽管这些技术在提高组织透明度方面取得了显著进展，但单纯的光学透明并不能确保复杂组织获得具有生物学信息的图像。分子标记，特别是核标记，对于定义细胞构筑地标、量化细胞群体以及实现与解剖图谱的空间配准至关重要。然而，在大多数现有工作流程中，标记通常在透明化之前或之后单独进行，这种分离导致了探针在致密组织中传输缓慢且不完全、处理时间延长增加组织变形和信号丢失风险、以及标记试剂与透明化介质之间的化学不兼容性等问题。这些问题严重限制了高分辨率三维成像的深度、均匀性和可重复性。为了解决上述局限，研究人员开发了 SynClear 策略，旨在通过将核标记直接整合到化学工程化的透明化系统中，实现清除与标记的同步进行。该研究发表于《Materials Today Bio》，其重要意义在于提供了一种快速、均匀且可扩展的容积组织成像平台，能够克服传统顺序工作流程中的动力学失配问题，为神经科学基础研究和转化病理学提供了新的技术手段。
**主要技术方法**
本研究采用的核心技术是 SynClear 一步法策略。该方法利用尿素（Urea）分子中两个氨基（NH
2）产生的强水合能力，破坏致密纤维蛋白的氢键网络，从而使透明化试剂和核探针能够同时渗透进入组织。研究人员通过系统优化缓冲剂、超水合试剂和折光率匹配化合物的配比，确定了由磷酸盐缓冲液（PBS）、尿素、D-山梨醇和碘海醇（Iohexol）组成的最终配方。实验样本主要包括 C57BL/6 小鼠、Thy1-GFP 转基因小鼠的脑及外周器官组织，胶质母细胞瘤（GBM）模型小鼠脑组织，以及来自国家健康与疾病人脑组织资源中心的死后人脑皮层组织。样本经固定和切片处理后，直接在含有荧光探针（如 PI、DAPI 等）的 SynClear 试剂中于 37°C 孵育，即可在 30 分钟内完成透明化与标记。成像主要利用 Olympus FV3000 等共聚焦显微镜进行大视野和高精度扫描，并通过 Imaris 和 Fiji 等软件进行三维重建与定量分析。
**研究结果**
**SynClear 同步透明化与标记的开发**
研究人员首先开发了 SynClear 配方，旨在解决传统方法中探针渗透有限、处理时间长和标记不均的问题。原理上，利用尿素破坏蛋白质氢键网络，使透明化剂和核探针协同渗透。实验结果显示，优化后的 SynClear 配方（含 PBS、尿素、D-山梨醇和碘海醇）能在 30 分钟内实现 500-μm 厚小鼠脑切片和 200-μm 厚人脑切片的均匀透明化和核标记，且适用于多种核探针（DAPI, SYTO, PI, TO-PRO-1）。在 Thy1-GFP 小鼠脑切片中，SynClear 不仅保持了 GFP 荧光的稳定性，还实现了全深度的均匀核标记。此外，该方法在高达 1 mm 的厚组织块中仍能保持信号强度和覆盖深度的均匀性，且细胞及亚细胞结构保存完好，支持下游定量分析。
**SynClear 在多种标记策略和组织类型中的广泛兼容性**
研究人员评估了 SynClear 与多种标记策略的兼容性。在 Thy1-GFP 小鼠脑中，SynClear 处理后的组织显示出均匀的 TO-PRO-3 核标记，且 GFP 信号在连续 3 天的试剂暴露中保持稳定。在免疫荧光染色方面，SynClear 处理后的脑组织能与多种抗体（如 MBP, NFL, CD31, Iba1, GFAP, Synaptophysin 等）及神经元特异性标记物（NeuN, CHAT, CR, PV, NPY 等）成功共标记，清晰展示了髓鞘、轴突、血管、胶质细胞及不同神经元亚型的精细结构。进一步将 SynClear 应用于小鼠肾、肝、脾、心等内脏器官，均实现了同步透明化和核标记，清晰保留了各器官特有的解剖结构（如肾小球、中央静脉、淋巴滤泡、心肌纤维等）。这表明 SynClear 具有广泛的组织适用性，支持高通量的三维形态计量分析。
**厚脑切片中的精确图谱注册**
空间配准是神经解剖学解释结构与功能关系的基础。SynClear 通过提供密集且均匀分布的三维核参考框架，增强了厚组织切片的图谱注册精度。在靠近 Bregma +2.3 mm 的厚冠状脑切片中，利用 SynClear 标记的细胞核和 NeuN 阳性神经元构建了三维坐标系，清晰 delineated 了皮层和纹状体等主要脑区的边界。高分辨率三维重建揭示了海马 CA 区和齿状回（DG）的层状结构和细胞排列，为亚区注释提供了明确的形态学线索。多模态兼容性使得研究人员能够在统一的空间框架内比较不同皮层区域的结构差异，例如发现尾状核（CPu）的血管密度低于外侧隔中间核（LSI），以及不同区域神经纤维排列方式的差异。此外，通过三维细胞计数，研究人员量化了抑制性微环路，发现皮层中副白蛋白阳性（Pv+）抑制性神经元的密度显著高于海马区，提示了区域特异性的抑制与可塑性平衡。
**胶质母细胞瘤相关病理重塑的多尺度三维剖析**
利用 SynClear 成像技术，研究人员对胶质母细胞瘤（GBM）模型进行了高分辨率三维分析。宏观上，全景成像揭示了 GBM 侧关键解剖标志物（如胼胝体小钳和尾状核）的严重破坏。定量分析显示，与正常脑组织相比，GBM 组织的核密度增加了 2.28 倍，平均核体积增加了 35.6%，而 GFAP+ 星形胶质细胞的比例显著下降，反映了肿瘤细胞的占位性增殖。在细胞水平上，观察到免疫微环境的重塑：GBM 相关的小胶质细胞从静息状态的分枝状转变为反应状态的变形虫状，其密度增加了 194%，细胞体体积增大，但表面积减少，分支复杂度显著降低（Sholl 分析显示分支交叉点减少 68%）。这些三维形态学变化揭示了从监视状态向促肿瘤微环境的转变，且这些变化在传统二维组织学中难以全面捕捉。SynClear 还能精确描绘临床 GBM 边界，通过核密度、体积和细胞异质性的连续变化评估肿瘤侵袭性。
**人脑皮层层状组织的三维映射**
人脑皮层的六层结构是高级认知功能的基础。SynClear 实现了厚人脑切片层状组织的高分辨率可视化。在额叶组织中，基于血管和核特征清晰区分了灰质和白质。定量测量显示，血管直径从浅层到深层逐渐减小，而在白质中再次增大；细胞密度从第一层（L1）到第三层（L3）增加，并在白质达到最大值。SynClear 的高分辨率还允许对神经元亚群进行亚型级别的表征。研究发现，NeuN+ 成熟神经元在第二层（L2）比例最高，而在第一层（L1）最低。抑制性 Pv+ 中间神经元在深层（特别是 L4）富集，而钙视网膜蛋白阳性（CR+）中间神经元则在浅层（特别是 L2）更为普遍。此外，SynClear 成像还解析了原位胶质细胞群之间的微结构相互作用，如小胶质细胞与星形胶质细胞之间的接触，暗示了其中枢神经系统稳态维持中的潜在作用。
**讨论与结论**
本研究介绍的 SynClear 策略通过将组织透明化和核标记整合到单一化学系统中，克服了传统顺序工作流程的局限性。其核心原理是利用尿素中氨基产生的强水合能力，溶解致密纤维并破坏氢键网络，使透明化剂和核探针同步渗透。这种集成提高了标记均匀性，缩短了处理时间，并支持多模态成像兼容性。在化学配方上，PBS、尿素、D-山梨醇和碘海醇的协同作用增强了组织通透性和光学均匀性，同时保持了探针稳定性。SynClear 不仅建立了用于三维空间分析的密集均匀核参考框架，实现了小鼠脑的精确图谱注册、GBM 模型中的跨尺度结构破坏和免疫重塑捕捉，以及人脑皮层的分层解析分析，还支持临床标本的三维评估。尽管目前该方法主要针对毫米级切片优化，且在更大样本和更复杂标记策略（如整体免疫染色或 FISH）的结合上仍有提升空间，但 SynClear 无疑为解决探针传输与标记动力学失配问题提供了化学集成的解决方案，为实现快速、均匀和可扩展的三维成像提供了通用平台，有望推动容积成像在基础研究和转化医学中的广泛应用。
