精准的药物疗效评估与高效的候选药物筛选是转化药理学的基石，能够直接支撑治疗方案优化、加速药物研发管线并改善患者临床结局。然而，用于上述任务的常规分析方法存在固有局限，包括侵入性、对细微分子变化灵敏度低、无法实现治疗动态的实时体内监测以及与生理相关疾病模型兼容性差。为满足这些未满足的临床需求，近红外（NIR）荧光探针凭借无创性、超高灵敏度、优异靶标特异性、操作简便、深层组织穿透性及成本效益等优势，已成为变革性工具，可在临床前及早期临床场景中实现药物作用的精准时空追踪。本综述全面梳理了用于药物疗效评估与高通量筛选（HTS）的NIR探针的合理设计与转化应用最新进展。具体而言，NIR探针可系统性检测药物诱导的生化及微环境改变，并与自动化HTS平台整合后显著提升筛选灵敏度、通量及生理相关性。最后，研究人员阐述了阻碍NIR探针技术广泛临床转化的关键挑战，并展望了未来研究方向。该领域的进展有望优化个体化药物治疗策略、加速后期临床试验验证，并推动全球制药行业的范式革新。
引言
药物治疗是管理糖尿病、高血压、癌症及严重感染等多种疾病的基石，药物的开发与有效利用依赖于对其药效学效应的深入理解。准确评估药物疗效不仅有助于优化个体患者治疗方案，还在药物发现过程中早期识别潜力候选药物方面发挥关键作用。传统药物治疗响应评估方法（如血液生化检测、组织病理学检查）长期作为标准手段，但均存在显著局限：血液检测可提供药物浓度与生化标志物定量数据，却常无法捕获作用部位的实时动态变化；组织病理学分析虽能反映组织层面改变，但具有侵入性且仅能提供特定时间点的静态疾病快照，且两类方法均无法同时监测药物作用与疾病进展的多参数变化。近年来，基于分子成像的荧光探针因操作简便、成本低及生物相容性好，成为实时动态体内药物疗效评估的重要工具。其中，近红外（NIR）荧光探针因更深的组织穿透性、更低的组织自发荧光及更小的光损伤等优势被广泛应用，且可通过理性调控荧光团分子结构，灵活设计“持续发光型”“激活型”与“淬灭型”探针，适配不同治疗适应症的监测需求，同时为疾病机制阐释提供手段。本综述聚焦NIR药物治疗响应监测探针（DTRMPs）的两大核心应用——用于疗效评估的药效动力学监测与高通量筛选（HTS），首先解析各类NIR探针的设计原理与激活机制，详述其在追踪多种疾病生物标志物（包括活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、活性硫（RSS）及活性羰基物种（RCS））、大分子动态（如酶活性、蛋白聚集及翻译后修饰）以及微环境参数（涵盖理化性质：粘度、极性；生化应激：pH、缺氧）中的效用；随后针对HTS应用，讨论NIR探针如何实现抗炎、抗癌、抗微生物等多治疗领域候选药物快速并行评估；最后总结当前挑战与未来方向，旨在加速DTRMPs的开发与临床转化。
DTRMPs用于药物疗效评估
荧光探针通过光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）、激发态分子内质子转移（ESIPT）及聚集诱导发光（AIE）等成熟传感机制发挥作用，并可结合磁共振成像（MRI）、光声成像（PAI）及荧光光谱分析（FSA）等互补成像模态，以更高时空分辨率可视化探针浓度与分布变化。靶标分析物的识别依赖探针与分析物的直接相互作用（包括配位与共价键合），辅以氢键、静电作用、π-π堆积、疏水效应及主客体络合等次级作用力。因此，针对特定生物标志物高亲和力设计的探针可作为药物疗效评估的有力工具：它们可反映给药后相关分子指标的变化，揭示药物诱导的内部微环境改变，本章从三个维度解析荧光诊断探针的机制。
监测反应性生化标志物
探针的高灵敏度与特异性可实现细胞内疾病相关标志物的精准监测，支撑早期疗效评估并及时指导剂量方案调整。
监测ROS
氧化应激（OS）源于内源性ROS促进细胞免疫激活，但过量ROS积累可引发免疫细胞死亡等有害效应。本节聚焦次氯酸（HClO）、羟基自由基（•OH）及超氧阴离子（O2•–）三类关键ROS在神经退行性疾病疗效评估中的应用。针对抑郁症治疗，Wang团队开发MB-Rs多功能荧光平台，以HClO可裂解的脲键为分子识别位点，裂解后释放亚甲基蓝及神经递质或抗抑郁药，伴随显著荧光增强（λem≈685 nm，检测限LOD=772 nM），实现药物递送与实时疗效监测同步，成功评估文拉法辛（Ven）、氟西汀（Flu）等6种常规抗抑郁药的潜在不良反应，指导更安全有效的抑郁症疗法开发。针对帕金森病，Deng团队开发DCM-PD2 NIR荧光探针，具备优异的血脑屏障穿透性、快速响应（30 min）、高灵敏度（LOD=22.9 nM）及650–680 nm发射，可无创成像帕金森病小鼠模型的•OH动态，追踪PC12细胞中波动，并成功评估姜黄素作为抗帕金森剂的疗效，为疾病机制解析提供工具。针对精神分裂症，Geng团队开发CT-CF3探针，O2•–特异性切除三氟甲磺酸酯基团后在665 nm产生强荧光（LOD=79 nM），利用该探针监测精神分裂症小鼠模型中O2•–的动态波动，评估非典型抗精神病药利培酮与奥氮平对脑氧化还原稳态的短期恢复效应。
监测RNS
过氧亚硝基阴离子（ONOO–）是关键RNS，参与众多生理病理过程。Li团队开发溶酶体靶向NIR开启型荧光探针BY-1（λem=668 nm），ONOO–特异性切割4-硝基苯基-2-氧代乙酰胺基团释放二氰基异佛尔酮荧光团并产生可检测的颜色变化，用于骨关节炎（OA）诊断，并通过监测ONOO–通道荧光动态评估金腰素D在OA小鼠模型中的治疗疗效。针对急性炎症，Ling团队报道基于噻唑烷二酮-呫吨染料的TX-P探针，通过去保护羟基检测ONOO–，在725 nm产生显著荧光开启（LOD=780 nM），证实布洛芬（IBU）、地塞米松（DXM）等的强效抗炎疗效。针对溃疡性结肠炎，Zeng团队开发DGO探针，响应动力学<60 s、高灵敏度（LOD=40 nM），ONOO–特异性切割苯硼酸酯释放荧光团，在710 nm产生NIR发射，用于检测姜黄素对溃疡性结肠炎的治疗效果并阐明其抗炎机制。一氧化氮（NO）是M1巨噬细胞活性的关键标志物，与癌症免疫治疗结局密切相关。Li团队开发BDP3荧光探针，基于PET脱氨基机制工作，最大发射波长668 nm，在皮下乳腺肿瘤小鼠模型中评估PLX3397与IBI308的体内重编程效应，证实其在监测免疫治疗响应中的效用。
监测RSS
生物硫醇是必需的内源性抗氧化剂，水平改变与肝毒性或其他疾病导致的肝损伤密切相关。Wang团队开发NIR-Lys-Cys新型NIR荧光探针，以丙烯酸酯为半胱氨酸（Cys）识别位点，通过迈克尔加成阻断ICT，产生强NIR发射（λem=690 nm，LOD=771 nM），灵敏检测细胞铁死亡、糖尿病进展及治疗干预诱导的Cys波动，证实白藜芦醇可升高糖尿病模型Cys水平，验证其抗糖尿病疗效。Shen团队开发DCI-AC-Cys NIR荧光探针，基于Cys触发的级联反应工作，发射波长705 nm、高灵敏度（LOD=42 nM）、快速响应（280 s），实现肝Cys波动实时追踪，证实水飞蓟素与姜黄素可显著降低酒精性肝病（ALD）小鼠模型Cys水平，体现治疗疗效。谷胱甘肽（GSH）水平改变提示药物性肝损伤（DILI）。Wang团队构建AH-F高选择性NIR荧光探针，通过亲核加成与级联反应工作，发射波长688 nm、斯托克斯位移150 nm，生理条件下稳定性优异，证实联苯双酯（DDB）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）与熊去氧胆酸（UDCA）可显著改善对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤。针对肥胖相关的下丘脑炎症，硫化氢（H2S）可作为反映全身代谢状态的生物标志物，Zhao团队设计NIR-HS探针，以二氰基异佛尔酮衍生物为NIR荧光团、2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸为识别位点，加入NaHS后在668 nm产生显著荧光，证实大蒜素通过释放H2S发挥抗肥胖效应。He团队开发NIR-II Cy3s系列染料，实现HClO/RSS的可逆检测，发射波长延伸至1040 nm，其中NIR-II-Cy3–988成功追踪急性炎症与肝损伤/修复模型的氧化微环境变化，反映阿司匹林（Asp）、双氯芬酸与IBU对炎症模型小鼠的治疗效应。
监测RCS
活性羰基物种（RCS）包括一氧化碳（CO）与丙二醛（MDA），异常浓度可触发细胞对羰基应激或免疫反应。Li团队开发QL-CO NIR荧光/光声（NIRF/PA）双模态探针，基于烯丙基连接的部花青染料，荧光LOD 360 nM、光声LOD 820 nM，发射覆盖700–790 nm，实现活体CO水平的无创灵敏可视化，并成功应用于评估地塞米松对急性炎症病灶的治疗疗效。MDA因比其他OS标志物更稳定，是动脉粥样硬化的理想氧化应激生物标志物。Ma团队设计MRM探针，酸性条件下激活730 nm NIR吸收与760 nm荧光发射，LOD 12.53 nM，结合高灵敏度光学成像与优异准确性，实现活体动物动脉粥样硬化斑块内MDA的可视化，成功评估普伐他汀、瑞舒伐他汀、维生素C与地塞米松在动脉粥样硬化（AS）小鼠模型中的治疗疗效。
监测物理微环境参数
病变环境中pH、极性、粘度、缺氧等物理参数的变化对可视化细胞环境动态变化与疾病诊断至关重要，检测此类微环境改变的荧光探针可实现给药前后病理生理变化的实时监测，支撑疗效评估。
监测粘度
细胞粘度异常改变与疾病进展密切相关，可破坏正常生理功能，粘度检测对监测生理活动与追踪微环境改变具有重要价值。Shi团队报道的探针在657 nm产生强NIR发射，可实现线粒体与溶酶体粘度变化的可视化。Chao团队开发的MBC-V与Ge团队开发的DPXBI均可用于肝损伤治疗剂的疗效评估。Dou团队设计WD-NO2粘度激活型NIR-II探针（λem=960 nm），不受pH与极性变化干扰，粘度升高时乙烯基的分子内旋转受限导致荧光恢复，成功检测糖尿病小鼠组织粘度升高，并监测白藜芦醇与二甲双胍（Met）的治疗响应。针对糖尿病肾损伤，Zheng团队采用“渐进优化（PO）”策略开发探针P4，发射峰760 nm、5 min内达到信号平台，评估Met对糖尿病的治疗效应，为药物开发评估提供工具。针对酒精性肝损伤（AALI），Wang团队开发PPBI双响应粘度-极性探针，粘度升高时分子旋转受限与扭转分子内电荷转移（TICT）抑制导致750 nm荧光增强，证实水飞蓟素可减少AALI模型的肝损伤并促进组织修复。针对动脉粥样硬化，Wang团队合成AS-CN D-π-A结构NIR探针，通过不同ICT机制独立检测HClO与粘度，粘度传感通道在710 nm发射且强度随粘度升高成比例增加，无创应用于动脉粥样硬化小鼠，通过联合粘度与HClO通道信号同时监测疾病进展并反映秋水仙碱的治疗效应。
监测极性
极性是生物系统的关键理化参数，异常改变与阿尔茨海默病、癌症等疾病密切相关。Lai团队开发LDs-BCA探针，通过活体肥胖小鼠胃脂肪成像追踪微环境变化，监测细胞内及胃组织内的脂滴（LD）代谢。Chen团队报道LD-DCM荧光探针，通过独特ICT机制将发射延伸至800 nm，用于对比健康、糖尿病及药物治疗后糖尿病小鼠的LD极性，有效反映二甲双胍的治疗效应，凸显糖尿病与LD极性改变的强相关性。Bian团队开发荧光探针DHBP，通过限制分子运动增强651–720 nm红通道荧光发射，有效监测糖尿病诱导肝损伤的粘度与极性变化，评估Met治疗糖尿病的有效性。Du团队设计LJ-LD探针，基于LD的极性敏感性工作，在1,4-二氧六环中发射波长650 nm，检测衰老、炎症、癌症等多种生理病理条件下的脂质极性与数量变化，评估阿奇霉素与Met在阿霉素（DOX）诱导的HepG2细胞衰老模型中的抗衰老潜力，证实其高灵敏度与可行性。
监测pH
细胞与微环境的pH稳态对维持正常生理功能至关重要。Shrestha团队设计Benz-NorCy7 pH响应型短波红外（SWIR）探针，偶联单克隆抗体（mAbs）用于评估分布、细胞摄取与蛋白降解，在酸性肿瘤微环境中激活，最大发射996 nm，肿瘤特异性优异，建立双色比率成像策略解决探针浓度与激活状态的信号串扰。针对胃部pH波动与胃病发病机制的相关性，Zhang团队设计Si-3Py超酸性NIR有机荧光探针，通过质子化触发从非荧光亚胺到荧光胺的状态转变，实现胃内pH动态实时成像（λem=680 nm，响应<1 min，pKa=2.32），监测抑酸效果并对比铝碳酸镁与奥美拉唑的抗酸疗效，证实奥美拉唑的更优抑酸效应。针对实体瘤治疗中顺铂的局部pH变化与不良反应的相关性，Guo团队开发MPH逻辑门控荧光传感器，实现顺铂激活过程中pH与ONOO–的双响应检测，单独响应H+时发射红光、单独响应ONOO–时发射蓝绿光，两者同时存在时无荧光，pH响应发射652 nm，监测顺铂治疗期间活细胞与体内的动态变化，证实间歇性尼格拉霉素可减轻顺铂诱导的副作用。
监测缺氧
缺氧是氧缺乏导致肝功能异常的关键指标，参与酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎与药物性肝损伤等多种肝病的发病。Yao团队设计AzoCy-CF3 NIR荧光与光声探针，用于非酒精性脂肪肝（NAFLD）的研究与治疗，整合噻吨-半花菁染料与3,5-二(三氟甲基)苯基偶氮基团，在体外与体内实现“缺氧-复氧”循环的可逆荧光与光声成像，缺氧条件下760 nm信号增强最高达96.3倍，评估6种保肝药物（奥贝胆酸（OCA）、奥利司他（OLST）、己酮可可碱（PTX）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、α-硫辛酸（α-LA）、S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM））的疗效，结果显示S-腺苷-L-蛋氨酸与奥利司他组的肝荧光降低更显著，证实其在缓解NAFLD进展中的更优疗效。
监测大分子动态
除小分子标志物与物理微环境外，监测疾病相关生物分子的结构与构象变化是评估药物疗效的关键途径。蛋白质可发生氧化、硝化等化学修饰改变结构，相分离等过程可诱导构象转变，基因突变、外源毒素与细胞应激也可触发蛋白错误折叠与聚集，进而扰动局部物理微环境，导致分子探针荧光信号的相应增减。通过追踪药理干预前后蛋白质的结构与构象动态，研究人员可高效监测药物诱导的生物分子扰动，阐明药物对蛋白结构/构象的作用机制与影响，进而评估治疗疗效。
监测酶
羧酸酯酶（CESs）水解多种前药发挥治疗作用，糖尿病会降低CES浓度，监测CES变化对糖尿病治疗至关重要。Sun团队设计一系列基于半花菁荧光团的NIR荧光探针（Hecy-1、Hecy-2、Hecy-3），发射波长720–732 nm，检测限1.744 mU/mL，利用Hecy-1成像观察到Met治疗组小鼠的荧光显著强于对照组，证实Met改善糖尿病条件的疗效。β-半乳糖苷酶（β-gal）是细胞衰老的合适生物标志物，也是识别衰老细胞（SNCs）的关键靶点。Li团队开发XZ1208 NIR荧光探针，特异性响应β-gal，β-gal切割糖苷键后探针发生自消除转化激活报告基团，在654 nm产生强荧光（斯托克斯位移170 nm），在自然衰老、全身照射（TBI）与早衰小鼠模型中具有高特异性与灵敏度，可实现长期标记（>6天）且无显著细胞毒性，精确监测ABT263清除SNCs的衰老溶解效应，在衰老研究与衰老相关疾病诊断中潜力显著。中性粒细胞与细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在急性肾同种异体移植排斥（ARAR）的发病中起关键作用。Cheng团队开发AMPros，首个可报告活体肾同种异体中中性粒细胞与CTL活性的肾脏特异性分子探针，通过两部分产生660 nm NIR荧光：AMProN检测中性粒细胞弹性蛋白酶，AMProT响应γ-谷氨酰转移酶（GGT）与颗粒酶B（GzmB），用于评估环孢素A（CsA）对肾自身免疫疾病的疗效与他克莫司在肾移植中的治疗效果，在ARAR模型中疗效显著。乙酰胆碱酯酶（AChE）降解神经递质乙酰胆碱，在乳腺癌病理生理中起关键作用。Wan团队设计PTQ-AChE探针，通过AChE介导的水解激活触发强ICT，产生约730 nm的强荧光，高灵敏度（LOD=0.015 U/mL），评估新斯的明的抑制作用与醋甲胆碱的激活作用，支撑乳腺癌模型中动态成像与药物疗效评估的进一步开发。
监测蛋白聚集
Aβ淀粉样蛋白沉积是阿尔茨海默病（AD）的关键病理特征，现有探针灵敏度有限导致早期诊断困难。尽管已有支链型荧光探针（DBPs）等报道，其中DBP-2选择性最高，发射峰682 nm，已验证可染色Aβ寡聚体，但探针的灵敏度与特异性仍需进一步提升。此外，FDA研究的靶向蛋白聚集药物临床成功率有限，多数仍处于早期研究阶段，目前尚无直接评估此类药物治疗AD疗效的探针报道。鉴于老龄化相关神经退行性疾病的负担日益加重，AD早期诊断方法与治疗药物的开发不容忽视，开发可评估药物疗效的探针有望显著加速AD治疗的研发与临床转化，是未来极具前景的研究方向。
监测蛋白质的翻译后修饰
纤维蛋白原是促血栓状态的指标并预测血栓形成倾向，纤维蛋白是冠状动脉微血管功能障碍（CMD）的生物标志物。Awen团队设计基于吲哚菁绿（ICG）偶联微泡的纤维蛋白识别探针T-MBs-ICG，发射波长840 nm，特异性结合纤维蛋白提供纤维蛋白沉积的分子水平信息，成功验证瑞舒伐他汀在心血管疾病模型中的治疗效果，证实其可减少心肌损伤部位的纤维蛋白积聚。荧光探针也为组织纤维化评估提供直接途径。肝纤维化期间，胶原蛋白发生氧化结构改变，赖氨酸残基被氧化为醛赖氨酸。Zhuang团队设计探针B1与B2，整合酰胺杂化荧光簇，以牛血清白蛋白（BSA）为模型蛋白，证实其对醛赖氨酸的荧光响应，发射波长约740 nm，高灵敏度与特异性，成像对比度比达260–2600倍（取决于纤维化严重程度），检测时效性提升，利用B2通过监测探针与蛋白醛赖氨酸偶联后的荧光强度，验证奥贝胆酸的抗肝纤维化效应。
DTRMPs用于药物筛选
如前所述，分子探针通过监测疾病特异性生物标志物与物理微环境参数的动态变化，实现实时药物疗效评估。药物发现的核心挑战之一是快速识别靶向治疗的活性化合物，荧光探针凭借实时检测能力，通过高通量筛选（HTS）平台满足这一需求。Zhang团队开发荧光探针DBX-AP，用于快速检测与成像二肽基肽酶-IV（DPPIV）活性，利用该探针鉴定出3种DPPIV抑制剂，建立开发新型抗糖尿病药物的高效平台。Zeng团队聚焦甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）这一细胞衰老的特异性标志物，设计探针SOMP，首次利用该探明确认姜黄素的抗衰老机制。Wang团队设计基于肽的探针FPy1，用于检测Caspase-1活性，利用FPy1筛选25种天然产物，成功鉴定脱氧核黄素为新型Caspase-1抑制剂。异常ONOO–水平是糖尿病肾病（DN）进展的关键指标，Chen团队建立基于ONOO–响应型荧光探针RNF的高通量筛选平台，利用该平台筛选15种天然产物来源化合物，鉴定黄芪多糖（APS）为ONOO–清除能力最强的化合物。
筛选抗炎药物
硒代半胱氨酸作为抗炎靶点
硒代半胱氨酸（Sec）是硒生物活性的关键介质，在抗炎反应中发挥重要作用。Liu团队开发Sec-BDP BODIPY基NIR荧光探针，高选择性、高灵敏度（LOD=85 nM，λem=765 nm），实现细胞、斑马鱼与小鼠炎症模型中Sec的动态活体成像，将Sec-BDP与超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）整合，鉴定黄芪中的强效抗炎成分，发现5-O-甲基维斯阿米醇苷（MeV）为潜力组分，其活性通过肝炎症期间Sec水平变化得以体现，推进了硒生物学研究并支撑更具靶向性的治疗策略开发。
巨噬细胞表型重编程
巨噬细胞是多种疾病免疫治疗的关键生物标志物与治疗靶点，不同表型在疾病进展与癌症治疗中发挥不同作用。Mo团队设计MPSNPr巨噬细胞表型特异性纳米探针，偶联Cy5.5（λem=702 nm），特异性识别GLUT1受体，建立可重编程巨噬细胞表型的小分子药物HTS平台，从60种提取物中筛选出促炎药物桦木酸（BA）与抗炎药物红景天苷（SAL），并将两者整合入多糖基纳米佐剂，验证实验证实其具有肿瘤抑制与抗炎疗效。
筛选抗癌药物
靶向DNA修复蛋白
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，着色性干皮病组B（XPB）蛋白是关键的核苷酸切除修复（NER）组分，作为关键生物标志物与治疗靶点。
