甲醇因可与现有基础设施兼容，且能够通过二氧化碳(CO2)与绿氢转化获得可再生来源，已成为一种可持续的C1原料。甲基营养型酵母，包括Komagataella phaffii（亦称Pichia pastoris）和Ogataea polymorpha，能够天然同化甲醇，因此是极具吸引力的生物制造宿主。然而，与糖基发酵相比，甲醇基工艺的工业应用仍受限于细胞毒性、氧化还原失衡以及生产力有限等问题。为应对这些挑战，研究人员已实施广泛的代谢工程策略，旨在增强甲醇同化能力并将碳通量重定向至高附加值产物。过去十年间，通过在非甲基营养型酵母中开发合成甲基营养途径、将产物谱系扩展至多糖类、脂肪酸衍生物、聚酮类化合物、萜类化合物、有机酸及多元醇，并结合多组学工具进行系统水平设计，该领域已取得显著进展。本综述总结了近期在甲醇同化增强、合成途径构建及发酵工程方面的进展，重点阐述了代谢工程与动态生物过程控制等策略。此外，文章还讨论了当前的挑战与未来展望，着重强调克服毒性、提高效率以及将先进甲基营养型酵母打造为稳健的细胞工厂，以服务于可持续的C1基生物制造。
- 1.
引言
气候变化减缓与可持续发展的紧迫性日益增加，推动了碳捕集与利用(CCU)技术的广泛关注。其中，通过电化学或热催化过程将二氧化碳(CO2)转化为甲醇已成为一种前景广阔的策略。甲醇作为一种高能量密度的液体，可由可再生能源生产，并能利用现有的燃料与化学品基础设施进行储存、运输和使用。随着利用CO2和可再生氢气生产绿色甲醇技术的进步，开发高效且可持续的下游利用平台变得愈发重要。传统上，甲醇在生物技术领域的应用较为有限，但利用生物路线将甲醇升级为高价值产物的研究正逐渐兴起。最具前景的方法之一是利用甲基营养型酵母的天然代谢能力，如Komagataella phaffii（亦称Pichia pastoris）和Ogataea polymorpha。这类酵母可通过木酮糖单磷酸(XuMP)途径将甲醇作为唯一的碳源和能源。甲醇同化过程定位于过氧化物酶体，依赖于醇氧化酶(Aox)和二羟丙酮合酶(Das)等关键酶，这些酶受到严格调控且可被甲醇诱导。历史上，甲基营养型酵母主要利用甲醇可诱导的AOX1启动子系统进行异源蛋白生产。其能够达到高密度生长，并具备翻译后修饰等真核特性，使其成为理想的重组蛋白生产宿主。然而，系统生物学、合成生物学及代谢工程的最新进展，使得这些生物体能够被重编程以生产多种生物产品，大大扩展了其在蛋白表达之外的用途。越来越多的研究证明，通过对甲基营养型酵母进行工程改造，可直接从甲醇生物合成有机酸、多元醇、脂肪酸衍生物甚至复杂的次级代谢产物。尽管潜力巨大，但仍存在若干代谢与生理挑战。甲醇代谢会产生甲醛等有毒中间体，若调控不当会抑制生长与生产力。此外，天然XuMP途径的碳通量并未自然优化以适应非天然化合物的高产合成。这些限制促使了通路平衡、动态生物过程控制及共底物补料等策略的发展。与此同时，合成甲基营养学的研究兴趣日益增长，即在非甲基营养型宿主中构建异源甲醇同化途径。这些努力扩展了可用于甲醇基生物生产的微生物底盘组合，并创造了利用常规宿主丰富的遗传工具、代谢多样性及成熟工业应用的机会。此类进展凸显了合成甲基营养作为一种多功能可持续策略的潜力，可利用固有的生物合成能力将甲醇转化为高附加值产品。本综述全面概述了利用甲基营养型酵母进行甲醇增值的最新进展，首先讨论天然甲基营养型酵母的核心甲醇同化途径及强化甲醇代谢的工程努力，随后介绍构建合成甲基营养型宿主的策略，接着重点阐述将甲醇转化为各类高附加值产品的代谢工程方法，以及影响甲醇基生产的关键发酵参数。这些见解共同提供了对甲基营养型酵母工程的综合视角，并强调了其对可持续C1基生物制造的潜在贡献。
- 2.
天然与合成甲基营养型酵母中甲醇同化途径的工程改造
微生物中的甲醇同化途径因其系统发育差异而各不相同。通常，原核甲基营养菌利用核酮糖单磷酸(RuMP)循环，甲醇首先被甲醇脱氢酶(Mdh)氧化为甲醛，随后通过3-己酮糖-6-磷酸合酶(Hps)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi)与核酮糖-5-磷酸(Ru5P)缩合，生成果糖-6-磷酸(F6P)等中心代谢物。相比之下，真核甲基营养型酵母，如K. phaffii和O. polymorpha，依赖定位于过氧化物酶体的木酮糖单磷酸(XuMP)途径。在该途径中，甲醇被Aox氧化为甲醛，随后甲醛与木酮糖-5-磷酸(Xu5P)在二羟丙酮合酶(Das)催化下反应生成二羟丙酮(DHA)和甘油醛-3-磷酸(G3P)，进入糖酵解途径。DHA随后被二羟丙酮激酶(Dak)磷酸化为二羟丙酮磷酸(DHAP)。这种过氧化物酶体定位的途径有助于隔离有毒中间体，并将甲醇衍生的碳导入中心代谢。多项研究致力于增强甲基营养型酵母的天然甲醇同化能力。研究人员通过在K. phaffii中引入胞质醇-醛转化系统，增强了甲醇代谢。通过过表达兼具醇脱氢酶和甲醛脱氢酶活性的双功能酶Adh900，实现了甲醇在细胞质中直接转化为甲酸，有效规避了过氧化物酶体内的甲醛毒性并加速了NADH再生。结合组氨酸补料以缓解Xu5P的前体竞争，该方法使干细胞重量增加了63%。另有研究表明，协调甲醛通量、氧化还原平衡与甲醇氧化的修饰可协同增强生长与甲醇同化。具体而言，通过删除甲醛脱氢酶(FLD)阻断甲醛向CO2的解离途径，同时过表达AOX1和DAS1以增强XuMP途径。其他修饰包括过表达果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)以增加Xu5P供应，过表达异柠檬酸脱氢酶(IDH)以支持NADH再生，以及过表达甲醇氧化酶(MOX)以提高甲醇氧化能力。最终，工程菌株的生长速率提高了4.08倍，甲醇利用效率较FLD单敲除菌株提高了10.26%。此外，优化天然甲醇代谢发生的过氧化物酶体环境对增强利用率至关重要。研究人员通过在O. polymorpha中过表达DAS2强化过氧化物酶体XuMP途径，显著加快了甲醛同化并减少了其毒性积累。作为补充，删除LPL1和IZH3以维持过氧化物酶体膜完整性，有效防止甲醛泄漏并增强了细胞对甲醇胁迫的鲁棒性。因此，这些过氧化物酶体特异性修饰导致了更快的甲醇消耗速率和更高的终细胞密度。除天然甲基营养菌外，研究人员还在非甲基营养型酵母中开展了大量构建合成甲基营养系统的尝试。在Saccharomyces cerevisiae中，异源表达XuMP途径基因（AOX、CTA1、DAS2和DAK2）使其能够消耗高达1.04 g/L的甲醇，并带来微小的生长提升（OD600提高3.13%）。添加酵母提取物进一步将甲醇消耗量提升至2.35 g/L，并支持生长增加11.7%。相比之下，将RuMP途径（MDH、HPS、PHI）引入S. cerevisiae未能支持其在甲醇上的生长。这些局限性源于合成甲基营养中公认的制约因素，包括氧化还原失衡、甲醇衍生的甲醛与戊糖磷酸途径之间的连接有限，以及甲醛解毒能力不足。研究人员通过对S. cerevisiae在甲醇和酵母提取物培养基中进行适应性实验室进化(ALE)，成功获得了携带转录因子YGR067C截短突变的菌株，使生长和甲醇利用率提高了44%。YGR067C编码一种Zn(II)2Cys6型转录因子，参与调控碳源利用和胁迫响应。该截短改变了其调控活性，重塑了转录网络以更好地适应甲醇代谢和氧化还原平衡。这突显了通过ALE进行转录重编程可以发现有助于合成甲基营养的非显而易见调控因子。产油酵母Yarrowia lipolytica通过引入MDH、XuMP途径基因（DAS、DAK）和RuMP途径基因（HPS、PHI）被改造为能够同化甲醇。为进一步增强碳同化，研究人员过表达了关键的戊糖磷酸途径基因（PFK、FBA、TKL1、RPE1和Bmg1pX），同时通过删除FLD阻断了甲醛解离途径。这些修饰将更多的甲醛通量导向同化而非解毒。所得菌株随后经过ALE，最终能够消耗1.1 g/L甲醇。另一项研究构建了多层工程化的Y. lipolytica菌株，能够共利用甲醇和木糖生产琥珀酸。通过引入AOX1、CAT1、DAK和DAS实现了甲醇同化，构建了甲醇氧化和XuMP途径。为支持XuMP循环活性，通过表达XYR、XDH和XK对菌株进行木糖利用工程改造，将木糖转化为木酮糖，进而生成木酮糖-5-磷酸(Xu5P)，这是Das同化甲醛所必需的C5糖磷酸。该策略确保了强健的胞内Xu5P库，从而促进甲醇同化。此外，通过过表达FBA2、TAL2和FBP1强化了戊糖磷酸途径(PPP)的碳通量，增强了Xu5P的再生。通过表达热休克蛋白70(Hsp70)增强了甲醇耐受性。此外，在三羧酸(TCA)循环中删除SDH5促进了琥珀酸的生产。在木糖共补料条件下，工程菌株消耗了5.2 g/L甲醇并产生了0.92 g/L琥珀酸，凸显了木糖来源的Xu5P供应和多途径整合在建立合成甲基营养中的有效性。研究人员还证明了通过合成甲醇-甲酸氧化-还原型甘氨酸(MFORG)途径，对S. cerevisiae进行工程改造以共利用甲醇和CO2的可行性。通过整合甲醇氧化基因（AOX、FLD、FGH和FDH）与还原型甘氨酸(rGly)模块（MIS1、GCV1–3和SHM1），构建了一株合成菌株(SMORG01)，能够在补充NaHCO3作为CO2源的甲醇上生长。在此条件下，菌株的OD600从0.20增加到0.35，伴随着甲醇和CO2的消耗。工程菌株还将同化的C1单元导向产物合成，产生了0.07 g/L乳酸和1.67 mg/L 5-氨基乙酰丙酸。这些结果确立了概念验证，表明非甲基营养型酵母可以被改造成具备合成甲基营养和CO2固定能力，以实现甲醇和CO2向增值化合物的转化。总体而言，天然和合成酵母中甲醇同化途径的工程改造显示了在扩展碳原料利用方面的显著进展。特别是S. cerevisiae和Y. lipolytica中的合成系统揭示了从头构建功能性甲基营养的复杂性，强调了与氧化还原失衡、戊糖磷酸途径连接性和甲醛解毒相关的瓶颈。尽管如此，最新进展表明，即使是非甲基营养型酵母也可以通过将通量重定向至高附加值产品来实现可测量的甲醇同化。尽管取得了这些成就，碳掺入效率和生长速率仍远低于天然甲基营养菌。因此，未来的工作将需要结合代谢重编程与系统级策略的综合方法，如辅因子工程、细胞器靶向和适应性进化，以实现具有工业竞争力的合成甲基营养。
- 3.
基于甲醇的细胞工厂的代谢工程策略
随着甲醇作为一种可持续原料的关注度不断提高，研究人员投入了大量精力对甲基营养型酵母进行工程改造，以生产多样化的生物产品。传统上，甲醇主要用作诱导剂，在生物量积累后实现目标途径的高水平表达。因此，甲醇诱导型启动子，如K. phaffii中的AOX1和O. polymorpha中的MOX，被广泛用于在诱导期或稳定期驱动限速酶或产物形成酶的表达。另一方面，组成型启动子（如GAP和TEF1）通常用于支持葡萄糖或甘油生长期间的前体供应。最近，除了作为单纯的诱导剂外，甲醇本身也被用作直接和唯一的碳源，用于天然甲基营养菌和工程合成甲基营养酵母的生物产物合成。尽管从甲醇获得的产物滴度通常仍低于传统糖基发酵，但最近的代谢工程策略已使甲醇基产量相较于早期研究有了显著提高。本章总结了代表性案例研究，并阐述了如何将甲醇同时用作诱导剂和底物来生物合成各种高附加值化学品的设计原则。通过脂肪酸途径的代谢工程，研究人员开发了甲基营养型酵母以从甲醇生产广泛的脂肪酸衍生制品。在K. phaffiiPC110中，通过在组成型TEF1启动子下表达非血红素脱羧酶(PfUndB)以及氧化还原伴侣putidaredoxin-putidaredoxin还原酶(CamA/CamB)，实现了甲醇到烃类的转化。为提高游离脂肪酸作为前体的可用性，删除了编码负责将脂肪酸导向β-氧化的脂肪酸酰辅酶A合成酶的FAA1。通过该组合策略，工程菌株以甲醇为唯一碳源获得了1.6 mg/L的长链α-烯烃（C15:1、C17:1和C17:2）。在K. phaffiiGS115中，通过表达CpFAH和CpDGAT1实现了羟基脂肪酸的修饰，分别由甲醇诱导型AOX启动子驱动，实现了Fah催化的羟基化和Dgat1介导的三酰甘油(TAG)储存。删除DES12调节了不饱和度，在甲醇诱导下产生了171.4 μg/mL蓖麻酸。将甲醇导向脂肪酸醇在O. polymorpha中需要与过氧化物酶体通量相匹配的还原步骤。将过氧化物酶体靶向的TaFAR1和ScADH5在OpTAL1诱导型启动子下表达，并结合组成型过氧化物酶体和中心碳增强模块（PXA1、PXA2、ScIDP2、RtME1、MDH3、PYC1和DAS2），以增强酰基输入、NADPH供应、苹果酸/丙酮酸穿梭和XuMP途径能力。删除HFD1、ARE、LPL1和IZH3减少了竞争性氧化和储存。在仅含甲醇和低甲醇补料的条件下，工程菌株产生了3.6 g/L脂肪酸醇。在K. phaffiiGS115中，实施了一种模块化策略，通过引入包括MmACL、BbXFPK、CkPTA、ScIDP2和DAS2在内的一组基因来增强乙酰辅酶A和NADPH的供应。对于产物形成步骤，FaCoAR基因在甲醇诱导型AOX启动子的控制下表达。此外，删除HFD1基因以防止醛氧化。该工程菌株利用甲醇作为唯一碳源产生了2.0 g/L脂肪酸醇。相对较高的游离脂肪酸(FFA)产量也在O. polymorpha中观察到。在O. polymorpha中，过表达FBP1、ZWF1、RPE、MmACL和ScIDP2加强了戊糖磷酸途径的通量，增加了乙酰辅酶A和NADPH的可用性，同时删除FAA1、LPL1和IZH3最小化了再酯化。在仅含甲醇的培养条件下进行适应性实验室进化，使得FFA产量高达15.9 g/L。同样，在K. phaffiiGS115中，组成型表达乙酰辅酶A和NADPH供应模块（MmACL、BbXFPK、CkPTA、ScIDP2、DAS2）结合删除FAA1和FAA2以阻断再摄取，导致从甲醇中产出23.4 g/L FFA。
3.1 脂肪酸衍生制品
如前所述，通过脂肪酸途径的工程改造，已实现多种脂肪酸衍生品的合成。
3.2 丙二酰辅酶A衍生制品
甲基营养型酵母中也展示了利用甲醇生产丙二酰辅酶A衍生制品的能力。首先，通过策略性地将关键途径基因置于甲醇诱导型启动子下，增强了Komagataella phaffii中通过合成β-丙氨酸途径生产3-羟基丙酸(3-HP)的能力。该源自GS115的菌株被改造为表达PANDTc以进行天冬氨酸-1脱羧，表达BAPATBc和PseFDH以进行β-丙氨酸转氨和氧化还原平衡，以及表达YDFGEc以进行后续的3-HP形成。为维持前体平衡，通过过表达PYC2强化了TCA循环的回补能力，从而补充了天冬氨酸和β-丙氨酸形成所需的草酰乙酸库。通过引入作为乳酸或单羧酸转运蛋白发挥作用的ESBP6Sc和JEN1改善了3-HP的输出。该过程包括基于甘油的生物量生长、向甲醇补料的过渡以及指数甲醇补料阶段。结果，性能最佳的菌株达到了27.0 g/L的3-HP产量。在O. polymorpha中，通过实施丙二酰辅酶A还原酶(MCR)途径也实现了3-HP的生产，MCR基因在甲醇诱导型AOX启动子下表达以驱动产物形成的还原步骤。通过TEF启动子组成型表达MmACL和ACC1，以及GAP启动子下的ZWF1和GND1，强化了前体和辅因子的供应。这种组合设计使得在周期性补料条件下，利用甲醇生产了7.10 g/L的3-HP。K. phaffiiPC110中的高滴度3-HP生产系统是通过整合AOX启动子驱动的MCR表达与在内源性UTR1和DAS2启动子控制下的增强过氧化物酶体甲醇同化实现的，同时通过用弱TEF1启动子替换天然FLD1启动子下调了甲醇解离途径。结果，工程菌株在甲醇补料生物反应器中实现了48.2 g/L的3-HP滴度。另一种代表性的丙二酰辅酶A衍生制品——三乙酸内酯(TAL)，在GS115菌株中生产，采用了组成型前体供应盒，包括TEF驱动的Gh2PS、ScACC1、XDH、XKS和PTA，以及GAP驱动的XR和xPK，以增强丙二酰辅酶A、乙酰辅酶A和戊糖磷酸途径的通量。当直接在20 g/L甲醇上培养时，该菌株产生了57.1 mg/L TAL。
3.3 甲羟戊酸(MVA)途径衍生制品
鉴于甲羟戊酸(MVA)途径在合成多种萜类化合物方面的多功能性，甲基营养型酵母中也报道了利用甲醇生产MVA途径衍生制品。(+)-努特卡酮是一种高价值的倍半萜酮，具有葡萄柚的特征香气，广泛用于香料、香精和驱虫剂应用，在K. phaffii中生产。对于(+)-努特卡酮的生产，K. phaffiiCBS7435被改造为包含甲醇诱导表达的瓦伦烯生物合成和氧化模块，包括AOX启动子驱动的HPO、CPR、ValS、tHMG1和ADH-C3。瓦伦烯合酶和细胞色素P450催化的氧化步骤在葡萄糖生物量积累后的甲醇诱导下共表达，获得了208 mg/L的(+)-努特卡酮。异戊二烯是一种关键的五碳构件，广泛用作合成橡胶和各种工业聚合物的前体，也在O. polymorpha中生产。通过表达异戊二烯合酶(IspS)和截短的HMG-CoA还原酶(tHMGR)于甲醇诱导型MOX启动子下，实现了异戊二烯的生产，从而将异戊二烯生物合成途径与甲醇氧化相结合，产生了4.4 mg/L异戊二烯。番茄红素是一种红色类胡萝卜素色素，广泛用作食品和制药应用中的营养保健品和抗氧化剂，在K. phaffiiGS115中生产。通过堆叠诱导型萜类和甲羟戊酸途径模块，包括AOX启动子下的crtE、crtB、crtI、HMGR、HMGS和GGPPS，增强了类胡萝卜素的番茄红素通量。先用甘油培养生长，再进行甲醇诱导，获得了0.714 g/L的番茄红素滴度。玉米素A1是一种倍半萜植保素，具有抗菌活性，在植物防御工程中有潜在应用，通过多重组成型甲羟戊酸和修饰模块的构建，在K. phaffiiPC111中生产。工程改造包括TEF启动子驱动的BdTPS2、ERG13、ERG8、AaCPR和FBP1，以及GAP启动子驱动的ERG20、tHMGR、ERG10、ERG12和ZmCYP71Z18，还有ADH2启动子驱动的IDI1和SOL3以及pDAS2驱动的DAS2。为了将碳通量从固醇合成中重定向，通过将ERG9与GGGGS连接子和CLN2-PEST降解标签融合并使其不稳定，从而在不消除功能的情况下降低了角鲨烯合酶的稳定性。在甘油生长后进行甲醇诱导，该系统产生了102.5 mg/L玉米素A1。研究人员还证明了另一种倍半萜α-红没药烯在K. phaffii中利用甲醇生产。GCW14启动子用于驱动FPPS-AgBIS（α-红没药烯合酶）和FPPS-AaFS（β-法尼烯合酶）融合酶，而TEF1启动子驱动的tHMGR、ERG10和HMGS表达增强了上游MVA通量。通过过表达TEF1启动子-MK和ADH2启动子驱动的PMK、MVD和IDI进一步加强了中间MVA途径，使得在摇瓶培养中利用甲醇产生了270 mg/L α-红没药烯和338 mg/L β-法尼烯。在O. polymorpha中，β-法尼烯（一种无环倍半萜，用作香料成分和生物燃料的可再生前体）的产量在单一甲醇上达到14.7 g/L，通过将倍半萜途径基因分配到不同的启动子下实现，TAL1启动子驱动AaFS、ERG20、tHMGR、SpHMGR、POX、MFE1和POT，GAP启动子驱动AaFS、ERG10、ERG12、ERG13、ERG20、ERG8、ERG19和IDI。此外，破坏MLS1缓解了乙醛酸分流对乙酰辅酶A的消耗，进一步增强了倍半萜通量。
3.4 聚酮化合物衍生制品
甲基营养型酵母中也利用甲醇生产了聚酮化合物衍生的天然产物，凸显了这些宿主在复杂次级代谢产物生物合成方面的潜力。6-甲基水杨酸(6-MSA)是一种聚酮代谢物，是多种药物和自然产物的前体，在K. phaffiiGS115中证明了其生产。磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(NpgA)和6-甲基水杨酸合酶(AtX)在AOX1启动子下的诱导表达使得6-MSA得以产生，甘油补料后进行甲醇诱导，产量高达2.2 g/L。桔霉素是一种聚酮真菌毒素，常作为聚酮生物合成的模型进行研究，在K. phaffii中生产。通过引入pksCT（组装桔霉素骨架的聚酮合酶）、npgA（PKS活化所需的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶）和修饰基因mpl1（促进中间体释放的丝氨酸水解酶）、mpl2（氧化酶）和mpl4（醛脱氢酶）重建了生物合成途径，这些基因均在甲醇诱导型AOX启动子下表达，而mpl6（短链脱氢酶）和mpl7（氧化还原酶）则在GAP启动子下组成型表达。在葡萄糖上培养并进行甲醇脉冲诱导，产生了0.6 mg/L桔霉素。洛伐他汀是一种聚酮他汀类药物，通过抑制HMG-CoA还原酶广泛用作降胆固醇药物，也在K. phaffii中生产。他汀生物合成模块被刻意分配到不同的菌株中，并使用荧光标记进行追踪。共培养P. p/BCGN_GFP（携带pAOX-lovB、lovC、lovG、npgA；GFP标记）和P. p/FNsD_RFP_sAR（pAOX-slovA、slovD、lovF、npgA、cpr；RFP标记）在甘油生长后进行甲醇诱导，产生了250.8 mg/L产物。
