三羧酸（TCA）循环是中心代谢枢纽的核心组成部分，为细胞提供能量与生物合成前体。高效调控中心碳通量对维持微生物细胞工厂（MCFs）的最优生产效率至关重要，但目前能够感应TCA循环中间产物的生物传感器仍十分有限。研究人员对源自芽孢杆菌属的分解代谢控制蛋白C（CcpC）进行工程化改造，在大肠杆菌中重构了柠檬酸响应型生物传感器。通过杂交启动子工程策略，研究人员系统表征并明确了CcpC两个结合位点的功能作用。采用杂交启动子设计的工程化生物传感器BcCcpC-PLBs在同类型器件中表现出最宽的动态范围与最高的表达水平。配体谱分析显示BcCcpC对多种TCA循环代谢产物具有广谱响应性。通过结构导向的CcpC定点突变，获得的突变体BcCcpC(S138L)在80 mM柠檬酸诱导下动态范围提升至3.02倍。该研究首次建立了基于转录因子（TF）的柠檬酸响应型生物传感器，拓展了中心代谢工程调控工具库。
本研究发表于《ACS Synthetic Biology》，针对微生物细胞工厂生产中中心碳代谢通量难以动态感知与调控的瓶颈问题展开。当前针对TCA循环关键节点代谢物柠檬酸的遗传生物传感器十分匮乏，限制了基于代谢状态的动态调控策略开发。研究人员从芽孢杆菌属挖掘并工程化了转录因子CcpC，在大肠杆菌中成功构建了首个转录因子型的柠檬酸响应生物传感器系统，解析了其调控机制并完成性能优化，为精细调控微生物细胞工厂提供了新型工具。
关键技术方法方面，研究人员首先从三种芽孢杆菌中筛选CcpC同源蛋白及其天然启动子，在大肠杆菌中构建双质粒表达系统；随后通过杂交启动子设计，将CcpC结合位点模块化整合至组成型启动子骨架，实现功能元件的解耦与表征；进一步利用AlphaFold3预测蛋白结构并结合分子对接锁定配体结合口袋关键残基，通过定点突变获得性能增强突变体；最后在不同碳源培养基中通过荧光定量检测完成生物传感器的动态范围与配体特异性评价。
研究结果分为以下部分：
- 1.
芽孢杆菌CcpC同源蛋白的挖掘与鉴定
研究人员选取淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的CcpC同源蛋白，比对发现其序列同源性差异显著但结合位点高度保守。在大肠杆菌中重构天然启动子系统后，三种同源组合均表现出柠檬酸依赖性激活，其中淀粉芽孢杆菌与蜡样芽孢杆菌系统的动态范围分别达3.29倍和2.87倍，枯草芽孢杆菌系统则因基础表达较高导致动态范围仅为1.77倍。
- 2.
基于杂交启动子的CcpC结合位点功能表征
研究人员设计三类杂交启动子验证作用机制：将双结合位点置于强组成型启动子上游时，柠檬酸-CcpC复合物可招募RNA聚合酶（RNAP）并使荧光强度提升3.99至7.09倍，证明其具有转录增强功能；仅保留结合位点I时，CcpC持续结合并造成62.24%至94.33%的转录抑制，表明其为稳定锚定位点；仅保留结合位点II时，柠檬酸诱导下CcpC解离并解除抑制，证实其发挥配体响应开关作用。
- 3.
大肠杆菌中柠檬酸响应CcpC生物传感器的开发
研究人员构建整合双结合位点的PLBx系列杂交启动子，并通过降低IPTG诱导浓度将蜡样芽孢杆菌系统的动态范围优化至2.85倍。跨物种配对实验表明，蜡样芽孢杆菌CcpC与枯草芽孢杆菌来源启动子组合的BcCcpC-PLBs表现最优，兼具高荧光输出与宽动态范围。
- 4.
BcCcpC-PLBs生物传感器的配体谱分析
该生物传感器对六种TCA循环中间产物均有响应，其中柠檬酸诱导的动态范围最高（2.70倍），草酰乙酸次之（2.22倍），其余代谢物响应较弱，证明BcCcpC对结构相似羧酸盐具有一定交叉反应性，但仍以柠檬酸为主要配体。
- 5.
面向TCA代谢物感知的BcCcpC调控蛋白工程
研究人员通过结构模拟锁定配体结合口袋的5个关键残基并进行饱和突变，筛选出S138L与S138R两个性能显著提升的突变体。分子模拟显示突变缩小了结合口袋体积并增强了配体亲和力，其中BcCcpC(S138L)-PLBs在80 mM柠檬酸下的动态范围达3.02倍，且对其他TCA代谢物的响应未受明显干扰。
讨论与结论部分指出，本研究通过杂交启动子工程明确了CcpC双结合位点的分工机制，开发的生物传感器不仅可感知柠檬酸，还能反映TCA循环整体代谢状态。结构导向的蛋白改造有效提升了器件灵敏度，为中心碳代谢工具的开发提供了新范式。研究人员强调，未来可通过进一步优化配体选择性与动态范围，推动该类生物传感器在微生物细胞工厂动态调控中的实际应用。
