甲酸氢裂合酶（FHL）对于稳定期大肠杆菌的pH稳态、ATP水平维持以及CO2供应至关重要

甲酸氢裂合酶（FHL）在进化上与线粒体复合体I相关。大肠杆菌中甲酸诱导型FHL-1在混合酸发酵过程中催化甲酸歧化生成H₂和CO₂。与许多微生物（包括大肠杆菌）中存在的FHL-2酶相比，FHL-1仅拥有通常五个膜结构域亚基中的两个，这或许解释了其明显的跨膜质子转运能力的缺失。然而，这引出了关于FHL-1酶的生理功能的问题。本研究证明，FHL-1在稳态发酵细胞中负责调节胞内pH和CO₂水平。通过对有和无FHL-1酶的大肠杆菌菌株进行胞内外pH值测定，研究人员发现缺乏FHL-1的细胞胞质碱化（0.5 pH单位）。该胞内pH（pHi）的升高与这些细胞中ATP浓度随之三倍下降相关，而亲本菌株则保持了高ATP水平和6.7的pHi。突变体中ATP水平的降低与F₁F_o-ATP酶（F₁F_o-ATPase）活性的增加相关。值得注意的是，FHL-1阴性突变体的ATP水平和pHi可通过在碳酸氢盐存在下生长恢复至接近野生型水平。综合这些数据表明，FHL-1的功能是为关键的羧化反应提供CO₂/碳酸氢盐，同时维持胞内pH稳态，从而通过防止F₁F_o-ATPase为中和pHi而进行的过度ATP水解来间接优化ATP水平。胞质定位的FHL-1产生的CO₂取代了丙酮酸脱羧反应，并解释了为何维持甲酸稳态是混合酸发酵的核心。重要性：肠道细菌混合酸发酵的标志性分子甲酸，由甲酸氢裂合酶（FHL）歧化为H₂和CO₂，这是一种进化古老的酶，在系统发生学上与质子转位复合体I相关。然而，由于大肠杆菌的FHL-1缺乏转位质子的能力，其生理作用仍不清楚。本研究发现，FHL-1在稳态细胞中具有维持pH稳态和胞内CO₂/碳酸氢盐水平的功能。缺乏功能性FHL-1的突变体无法产生H₂和CO₂，导致F₁F_o-ATP酶激活，该酶通过水解ATP来维持中性胞质pH。甲酸合成与其胞内歧化之间的平衡对于维持羧化反应所需的碳酸氢盐供应是必要的，从而确保pH稳态和最终的optimal ATP水平，共同有助于稳态期的存活。

## 研究背景与意义
混合酸发酵是大肠杆菌等肠道细菌在厌氧条件下的一种重要代谢途径，其标志性特征是丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶（PflB）裂解产生大量甲酸和乙酰辅酶A。甲酸随后可被甲酸氢裂合酶（FHL）歧化为H₂和CO₂。大肠杆菌中的FHL-1酶复合物在进化上与线粒体呼吸链的质子转位复合体I（NADH脱氢酶）具有共同祖先，但现有的序列和结构比较表明，FHL-1可能不参与能量守恒，这主要是因为其膜结构域仅含有两个“锚定”亚基（HycC和HycD），而非典型FHL-2复合物的五个亚基。这一结构特征引出了一个核心问题：既然FHL-1似乎不具备跨膜质子转运功能，那么它的主要生理作用是什么？已知FHL-1的合成由甲酸诱导，属于甲酸调节子的一部分，其表达受转录激活因子FhlA调控。在发酵过程中，甲酸积累到毫摩尔浓度，其代谢平衡对细胞至关重要。然而，FHL-1的具体生理功能一直不明确，有研究推测其可能与pH稳态或酸耐受有关，但缺乏直接证据。因此，本研究旨在阐明FHL-1在稳态期大肠杆菌中的确切功能。

## 主要研究方法
研究人员采用了以下关键技术方法：使用大肠杆菌亲本菌株（DH4100）、其同源的fhlA缺失突变体（DH5000）以及仅缺失氢酶3结构亚基的hycA-I缺失突变体（HD700）作为研究模型。通过构建携带野生型fhlA基因或完整hycA-I操纵子的质粒（pSA32，pRBH）进行遗传互补实验。在严格厌氧条件下，使用含葡萄糖的M9最低培养基培养细胞。通过监测培养液的光密度（OD₆₀₀）跟踪生长曲线。胞外和胞内pH值分别使用pH计和荧光染料BCECF-AM（2′,7′-双(2-羧乙基)-5-(和6)-羧基荧光素乙酰氧基甲酯）进行测定。胞内ATP浓度通过荧光素酶发光法检测。胞外甲酸浓度通过高效液相色谱（HPLC）在210 nm波长下测定。胞内甲酸水平间接通过携带甲酸敏感型启动子驱动的lacZ报告基因（fdhFP::lacZ）的β-半乳糖苷酶活性来评估。膜囊泡中的总ATP酶和F₁F_o-ATPase活性通过测定无机磷（Pi）释放量来确定，后者通过DCCD（N,N′-二环己基碳二亚胺）抑制法计算得出。H₂产量通过气相色谱法测量。研究团队还使用了质子梯度消散剂CCCP（羰基氰化物-间-氯苯腙）来研究质子动力势与ATP水平的关系。

## 研究结果
**缺乏功能性FHL-1的细菌更早进入稳定期**
对亲本菌株（DH4100）和fhlA缺失突变体（DH5000）的厌氧生长曲线分析表明，两者具有相似的滞后期和指数生长期。然而，突变体进入稳定期的时间更早（约6.5小时），且达到的最终细胞密度更低（OD₆₀₀约为0.6，而亲本菌株约为0.9）。这种生长缺陷特异于FHL-1功能的丧失，因为仅缺失氢酶3结构亚基的HD700菌株表现出与DH5000相似的生长表型。将携带野生型fhlA基因的质粒pSA32导入DH5000或导入包含完整hyc操纵子的pRBH质粒导入HD700，均可恢复菌株的发酵生长能力和H₂产生能力。

**稳定期培养基中甲酸水平差异**
在指数生长期，两种菌株培养基的pH值变化相似。然而，一旦进入稳定期，亲本菌株培养基的pH值急剧下降至5.3，而突变体DH5000的培养基pH值降至5.1。相应地，在稳定期，DH5000培养基中积累了更高浓度的甲酸（15 mM OD₆₀₀^-1），约为亲本菌株（8 mM OD₆₀₀^-1）的两倍。这表明由于无法合成FHL-1进行歧化反应，突变体排出了更多的甲酸。

**稳定期细胞内甲酸水平急剧下降**
利用lacZ报告系统监测发现，在亲本菌株的稳态期细胞中，胞内甲酸水平（通过β-半乳糖苷酶活性间接反映）较生长期细胞下降了约10倍。这证实了在稳态期，即使缺乏FHL-1，胞内甲酸也会被大量消耗或排出，但消耗途径发生了改变。

**fhlA突变体中胞内pH与ATP水平呈负相关**
对胞内pH（pHi）的测定显示，在稳态期（相E），亲本菌株的pHi降至约6.7，而fhlA突变体的pHi则升高至约7.2，表明胞质碱化。与此同时，突变体细胞内的ATP浓度较亲本菌株下降了近三倍。这种pHi升高和ATP降低的相关性在仅缺失FHL-1的HD700突变体中同样存在。遗传互补实验证实，恢复FHL-1功能可使ATP水平和pHi恢复至接近亲本菌株的水平。

**fhlA突变体稳态期F₁F_o-ATPase活性增高**
通过测定膜囊泡中的ATP酶活性，研究人员发现，在稳态期，fhlA突变体（DH5000）中F₁F_o-ATPase贡献的活性占总活性的77%，而亲本菌株中仅占55%。这表明在稳态期，突变体细胞中F₁F_o-ATPase的活性比例显著升高，这与其ATP水平降低的现象一致，提示可能存在过度的ATP水解。

**质子梯度消散对ATP水平的影响**
分析两种菌株的ΔpH（pHi - pHo）发现，在稳态期，亲本菌株和突变体分别形成了约1.5和2.2个单位的显著pH梯度。使用解偶联剂CCCP短暂消散质子梯度后，在稳态期的亲本菌株细胞中，ATP水平急剧下降至与未处理的fhlA突变体相当的水平。这直接证明了质子梯度（ΔpH）与ATP水平维持之间的紧密联系，并支持FHL-1功能的缺失会导致细胞依赖F₁F_o-ATPase水解ATP以补偿pH失衡。

**碳酸氢盐可恢复fhlA突变体的生长、ATP水平和pHi**
在培养基中补充50 mM碳酸氢盐，显著提高了fhlA突变体（DH5000）和亲本菌株的稳态期细胞密度。在此条件下，突变体的胞内ATP水平恢复了约2.5倍，其pHi也从约7.2恢复至接近亲本菌株的6.73。同时，两种菌株培养基中的甲酸排泄量均大幅增加。这些结果有力地表明，外源碳酸氢盐可以补偿因FHL-1缺失而造成的胞内CO₂/碳酸氢盐供应不足，从而纠正pH失衡和ATP消耗问题。

## 讨论与结论
本研究揭示了大肠杆菌甲酸氢裂合酶（FHL）的一个此前未被充分认识的关键功能：在稳态发酵期细胞中，FHL-1并非主要用于能量守恒（与其进化同源的复合体I不同），而是通过催化甲酸歧化生成CO₂，为重要的羧化反应（如乙酰辅酶A羧化反应）提供必需的碳酸氢盐底物。这一过程对于维持胞内pH稳态至关重要。

当FHL-1功能缺失时，细胞无法内源性产生CO₂/碳酸氢盐。这可能导致了胞内碱化（pHi升高），具体机制尚不完全清楚，但可能涉及CO₂/碳酸氢盐缓冲系统的失衡。为了中和升高的pHi，细胞过度激活了F₁F_o-ATPase，该酶通过水解ATP将质子泵出胞外，试图恢复pH平衡。然而，这种代偿机制的代价是ATP的大量消耗，最终导致ATP水平显著下降和细胞生长受损。研究证实，通过外源补充高浓度碳酸氢盐可以绕过对FHL-1的需求，直接提供羧化反应所需的碳酸氢盐，从而恢复pH稳态和ATP水平。

因此，FHL-1的生理重要性在于：它将甲酸代谢与碳固定（通过提供CO₂）、pH调节以及能量代谢（ATP水平）联系起来。这一发现解释了为何在混合酸发酵中，甲酸的合成（由PflB催化）与其细胞内歧化（由FHL-1催化）之间必须保持精妙的平衡。FHL-1通过提供CO₂/碳酸氢盐，间接地协助维持了有利于细胞在稳态期存活的胞内环境。研究结论是：**在稳态期大肠杆菌中，甲酸氢裂合酶（FHL）的核心生理功能是提供CO₂/碳酸氢盐，这对于关键的羧化反应是必需的；该过程同时有助于维持胞内pH稳态，并通过防止F₁F_o-ATP酶过度水解ATP来间接优化细胞的ATP水平，最终促进稳态期的存活。**