NMDA和甘氨酸受体对小脑浦肯野细胞攀缘纤维输入的双突触前调节作用

： 突触前受体是中枢神经系统（CNS）活动的重要调节因子。研究人员利用振动分离的大鼠小脑浦肯野细胞标本，检测了突触前受体的分布情况。在该标本中，NMDA受体的免疫反应性与突触前标记物synaptophysin的抗体染色存在共定位现象。应用NMDA增加了抑制性和兴奋性突触电流的频率，这一效应可被添加1 mM Mg2+所阻断。单独应用高浓度甘氨酸（100 µM）时，也产生了类似的兴奋性输入刺激效应，该反应被500 nM士的宁（strychnine）阻断，但不被1 mM Mg2+阻断。甘氨酸和NMDA的刺激均产生了许多幅度约为200–600 pA的大振幅兴奋性突触后电流（EPSC）。这些事件的大小表明它们源于攀缘纤维（CF），而非平行纤维（PF）连接。与这一观点一致，最大的事件始终被河豚毒素（TTX）消除，且分离的浦肯野神经元对外周蛋白（peripherin，一种攀缘纤维标记物）呈阳性染色。最后，研究人员在脑片标本中检测了100 µM甘氨酸的效应。与在分离细胞中观察到的结果类似，100 µM浓度的甘氨酸刺激了大突触后电流，并且该效应被低浓度士的宁阻断。综上所述，研究结果表明，突触前存在NMDA和甘氨酸受体，两者均可作为攀缘纤维兴奋性递质释放的调节器发挥作用。

论文解读：《NMDA和甘氨酸受体对小脑浦肯野细胞攀缘纤维输入的双突触前调节作用》

研究背景与意义

中枢神经系统中，NMDA受体和甘氨酸（Glycine）受体在突触可塑性和神经信号传递中扮演着至关重要的角色。既往研究表明，突触前NMDA受体广泛分布于多个脑区，参与调节抑制性和兴奋性递质的释放。然而，关于小脑浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）的输入调节机制仍存在争议。一方面，虽然已有证据提示平行纤维（Parallel Fibres, PFs）终端可能存在突触前NMDA受体，但其确切功能及是否混淆于中间神经元终端仍有待厘清；另一方面，攀缘纤维（Climbing Fibres, CFs）作为浦肯野细胞最主要的兴奋性输入源，其与突触前NMDA受体的关联此前尚未见报道。此外，突触前甘氨酸受体在其他脑区已被证实能调节谷氨酸释放，但在小脑CF-PC突触中的作用仍是未知领域。鉴于此，研究人员旨在探究小脑浦肯野细胞突触前受体的分布及其对CF输入的调节机制，这对于理解小脑的运动学习和协调功能具有重要的生理学意义。该论文发表于《The Journal of Physiology》。

关键技术方法

本研究采用了两种主要的电生理标本制备技术：振动分离的单细胞标本和脑片标本。实验动物选用出生后第10天（P10）的Sprague-Dawley大鼠。在单细胞标本中，研究人员通过机械振动分离方法获取保留了活跃突触末梢的浦肯野细胞，并进行全细胞膜片钳记录。在脑片标本中，研究人员制备了300 µm厚的矢状面小脑切片，同样进行全细胞记录。数据分析方面，研究人员利用最大似然估计法拟合事件间隔分布，并使用Kolmogorov-Smirnov（KS）检验分析振幅累积分布的差异，辅以免疫组织化学染色验证受体的共定位情况。

研究结果

振动分离的浦肯野神经元保留兴奋性和抑制性末梢

研究人员首先确认了振动分离技术能有效获取形态完整的浦肯野细胞，这些细胞不仅保留了厚实的树突残干，其突触末梢仍具有活性（通过FM1-43染料内吞实验证实）。电生理记录显示，在未加阻断剂时，细胞在0 mV附近会产生双向电流，其中向内快速电流代表兴奋性突触后电流（EPSC），向外慢速电流代表抑制性突触后电流（IPSC）。通过特异性拮抗剂DNQX（AMPA受体阻断剂）和荷包牡丹碱（bicuculline，GABA_A受体阻断剂）的联合应用，研究人员证实了这些自发突触事件分别由谷氨酸能和GABA能输入介导。

Mg²⁺敏感的突触前NMDA受体调节递质释放

研究人员发现，应用NMDA（辅以10 µM甘氨酸或D-丝氨酸作为共激动剂）能显著增加自发突触事件的频率，且该效应伴随着大振幅事件比例的增加。免疫荧光染色显示，NMDA受体的GluN1亚基与突触前标记物synaptophysin存在强烈的共定位，证实了受体的突触前定位。进一步机制研究表明，NMDA引起的频率增加被1 mM Mg²⁺完全阻断，但不被MK801（离子通道阻断剂）以外的途径阻断，说明该调节依赖于Mg²⁺敏感的NMDA受体的离子传导机制。

突触前NMDA受体调节抑制性和兴奋性连接

通过药理学分离手段，研究人员明确了NMDA受体对两类输入的双向调节作用。在仅保留抑制性输入的实验中（加入DNQX），NMDA显著增加了IPSC频率；而在仅保留兴奋性输入的实验中（加入荷包牡丹碱），NMDA同样增加了EPSC频率，且这种增加表现为大振幅事件比例的上升。这表明突触前NMDA受体不仅能调节中间神经元对浦肯野细胞的抑制性输入，也能调节兴奋性输入。

甘氨酸受体同样调节兴奋性末梢的递质释放

研究发现，高浓度（100 µM）的甘氨酸单独应用也能引起突触事件频率的剧增，且主要表现为大振幅EPSC的增加。与NMDA受体不同，甘氨酸的这一效应不被Mg²⁺阻断，但能被低浓度（500 nM）的甘氨酸受体拮抗剂士的宁显著抑制。这确证了突触前甘氨酸受体在小脑CF-PC突触中的存在及其在调节谷氨酸释放中的功能性作用。

攀缘纤维片段保留在振动分离的神经元上

为了明确这些大振幅事件（200-600 pA）的来源，研究人员排除了平行纤维（通常产生小于30 pA的电流）的可能性，推测其来源于攀缘纤维。免疫染色结果显示，分离后的浦肯野细胞体周围存在外周蛋白（peripherin，CFs的特异性标记物）阳性的纤维片段。这证实了振动分离过程中，部分CF末梢及其轴突碎片仍附着在浦肯野细胞体上，从而产生了这些大振幅电流。

动作电位驱动甘氨酸和NMDA刺激的最大振幅事件

研究人员进一步探讨了大振幅事件的产生机制。实验表明，在应用TTX（电压门控钠通道阻断剂）的情况下，NMDA或甘氨酸仍能引起一定频率的小振幅事件增加，但最大的振幅事件（>100 pA）完全消失。这说明NMDA和甘氨酸受体的激活导致了CF末梢的去极化，进而激活电压门控钠通道产生动作电位，最终引发了大规模的谷氨酸释放。即便在没有动作电位的情况下，受体的激活仍能通过钙离子通道或内质网钙释放引起一定程度的递质释放。

脑片记录证实甘氨酸调节在完整结构中的存在

为了排除振动分离标本的结构特殊性，研究人员在完整的脑片标本中进行了验证。结果显示，应用100 µM甘氨酸同样能诱导浦肯野细胞产生大量大振幅sEPSC，且该效应可被士的宁阻断。这一结果证明了突触前甘氨酸受体对CF释放的调节在生理性的脑组织结构中真实存在。

讨论与结论

本研究首次提供了功能性证据，证明突触前NMDA受体和甘氨酸受体共存于小脑攀缘纤维末梢，并能双重调节谷氨酸的释放。

讨论部分指出，NMDA受体介导的调节依赖于其经典的离子通道特性（Mg²⁺敏感），而非代谢型通路。尽管以往关于小脑突触前NMDA受体的研究多聚焦于平行纤维或中间神经元，本研究通过振幅分析和TTX阻断实验，成功将这一机制锁定于攀缘纤维。对于甘氨酸受体的发现，研究人员排除了其通过NMDA受体（如GluN1/GluN3A复合物）发挥作用的可能，确认其为典型的士的宁敏感型甘氨酸受体。虽然小脑缺乏直接的甘氨酸能输入，但研究人员推测，伯格曼胶质细胞（Bergmann glia）表达的GlyT1转运体可能通过“逆向运输”提供甘氨酸，从而激活这些突触前受体。

结论认为，在发育早期（P10），突触前NMDA和甘氨酸受体构成了攀缘纤维-浦肯野细胞突触的重要调节机制。特别是甘氨酸受体，由于其不被Mg²⁺阻滞，可能在NMDA受体活性受限的条件下，提供了另一种去极化驱动力。这一双重调节机制的发现，不仅丰富了我们对小脑突触可塑性的认知，也为未来探索其在小脑发育成熟及运动协调功能障碍（如过度惊吓反应症）中的病理生理意义奠定了基础。