一种逼近金标准灵敏度的便携且多功能的金纳米棱镜热等离子体平台用于侧流生物分子检测

等离子体纳米颗粒因其独特的光学和热学特性，成为下一代诊断技术的理想选择。其中，金纳米棱镜（AuNPrs）因其各向异性几何结构、在近红外（NIR）区域可调的表面等离子体共振（LSPR）以及高光热转换效率而尤为强大。这些特性使其从被动标记物转变为主动的纳米传感器，能够放大诊断信号。基于这些优势，研究人员开发了两种基于AuNPr的传感平台：热侧流免疫测定（ThermoLFIA）和热寡核苷酸侧流测定（ThermoOLFA）。通过将AuNPrs与热响应基底耦合，两个系统均利用局部生热来提升分析灵敏度，实现远超传统金纳米球的视觉增强效果。ThermoLFIA实现了对胃肠道癌生物标志物（CEA、CA19-9、VEGF）的临床相关检测，其性能优于标准ELISA检测。同时，用DNA探针对AuNPrs进行功能化，使ThermoOLFA能够在25分钟内、无需扩增步骤的情况下，以与RT-qPCR相当的灵敏度检测SARS-CoV-2 RNA。这一概念验证研究证实，等离子体纳米棱镜能够驱动快速、便携且超灵敏的诊断，为具有强大临床和转化潜力的即时检测（POC）平台开辟了道路。

本文的核心研究内容是开发并验证了两种基于金纳米棱镜（AuNPrs）热等离子体效应的侧流检测平台，用于实现高灵敏度、便携式的生物分子检测。该研究背景在于，尽管诊断技术取得了进展，但许多癌症和传染病仍缺乏既廉价又足够灵敏的早期筛查工具，导致诊断常在疾病进展后才进行，治疗选择少且预后差。世界卫生组织（WHO）也强调了快速、分散化检测对于阻断传播链的重要性。现有的参考方法如ELISA和RT-qPCR受限于昂贵的设备、专业人员和较长的操作流程，限制了其可扩展性。因此，开发兼具高灵敏度、特异性、可量化输出且操作简便、成本低廉的便携式诊断平台至关重要。侧流检测（LFA）作为主要的POC形式，虽然易于使用，但常规LFA灵敏度较低且通常仅提供定性结果。近年来，将等离子体金纳米颗粒（AuNPs）作为光学和热学双报告标记物被探索用于克服这些限制。研究人员在前期工作中已证明，具有各向异性几何结构和强近红外吸收的金纳米棱镜（AuNPrs）在激光照射下，能产生足够的局部加热，在热敏纸上形成可见印记，从而绕过了使用红外热相机的传统步骤。为了将这种高灵敏度的热等离子体标记技术从实验室推向临床转化，本研究构建了两种端到端的诊断系统：ThermoLFIA和ThermoOLFA。研究人员开展了以下研究：首先，优化了AuNPrs的合成与规模化制备，并通过聚乙二醇（PEG）修饰和生物功能化（分别偶联链霉亲和素/生物素化抗体或DNA探针）使其具备特异性识别能力。其次，将功能化的AuNPrs集成到侧流试纸条中，并与热敏纸耦合，构建了ThermoLFIA（用于检测CEA、CA19-9、VEGF等胃肠道癌标志物）和ThermoOLFA（用于检测SARS-CoV-2 RNA）。研究得出结论：1）ThermoLFIA对CEA、CA19-9和VEGF的检测限（LoD）分别为2 ng mL^-1、5 ng mL^-1和0.3 ng mL^-1，达到了临床相关浓度范围，且在性能上可与商业化ELISA试剂盒相媲美。2）ThermoOLFA在缓冲液和通用运输培养基（UTM）中的LoD分别为1.32 pM和0.7 pM，无需逆转录或扩增步骤，其灵敏度与RT-qPCR（循环阈值Ct ≈ 35）相当，且检测时间在25分钟内。3）对104份临床鼻咽拭子样本的验证表明，ThermoOLFA检测SARS-CoV-2 RNA的敏感性为98.2%，特异性为95.9%，阳性预测值（PPV）为96.4%，阴性预测值（NPV）为97.9%，总准确率为97.1%，尤其在低病毒载量（Ct > 32）样本中实现了100%的检出率。该研究的重要意义在于，它证明了热等离子体纳米棱镜技术可以推动开发出快速、便携、超灵敏且可扩展的诊断工具，弥补了实验室级灵敏度与现场适用性之间的鸿沟。该平台具有高度的模块化和适应性，可用于检测多种靶标，为应对新兴威胁、慢性疾病或个性化诊断提供了快速的检测开发途径，在即时检测和分散化公共卫生监测方面具有显著潜力。该论文发表在《Small》杂志上。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：1）采用改进的无种子法（通过调控HAuCl₄/Na₂S₂O₃比例和温度控制）合成并规模化制备AuNPrs，并通过超速离心和琼脂糖凝胶电泳进行纯化。2）通过EDC/sulfo-NHS化学将AuNPrs分别与链霉亲和素（用于ThermoLFIA）或氨基修饰的多聚嘌呤反向Hoogsteen发夹（PPRH）DNA探针（用于ThermoOLFA）进行共价生物功能化。3）设计并制造了侧流试纸条，包括样品垫、硝酸纤维素膜（FF80HP）和吸水垫的组装，并使用自动化点样仪在检测线（TL）和控制线（CL）固定捕获抗体或链霉亲和素。4）将生物功能化的AuNPrs集成到试纸条中，并通过1064 nm近红外（NIR）激光照射检测线区域，利用AuNPrs的光热效应在背面的热敏纸上产生可视化热印记，并使用便携式光学读取器进行定量分析。5）利用扫描电子显微镜（SEM）、紫外-可见-近红外（UV-Vis-NIR）光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）和动态光散射（DLS）对纳米颗粒进行表征，并使用放射性同位素标记法定量偶联效率。6）使用由Aragon健康系统生物样本库（PT23/00146）提供的104份临床样本（55份RT-qPCR阳性，49份阴性）进行ThermoOLFA的临床验证。

**研究结果**
**2.1 热侧流检测方法原理**
ThermoLFIA和ThermoOLFA两种平台均基于等离子体AuNPrs的光热特性，采用统一的热读取机制，应用于两种不同的分子识别模式：基于免疫测定的蛋白质检测和基于核酸杂交的病毒RNA检测。ThermoLFIA采用经典的夹心法检测蛋白质生物标志物（如CEA、CA19-9、VEGF），其中检测抗体通过生物素-链霉亲和素相互作用偶联到AuNPrs上。ThermoOLFA则使用合成DNA探针检测核酸靶标，采用夹心型杂交方案，其中两个序列特异性寡核苷酸探针（检测探针和捕获探针）协同结合靶RNA的相邻区域。检测探针基于PPRH设计，并共价连接到AuNPrs上；捕获探针在3’端携带生物素基团，通过强生物素-链霉亲和素相互作用将杂交复合物固定在检测线。两种形式均依赖相同的检测原理：激光照射检测线会诱导积累的AuNPrs产生局部发热，热敏纸通过变色将热信号转化为可见印记，信号强度与分析物浓度成正比。在高浓度时，硝酸纤维素膜正面会出现可见的比色信号（AuNPrs的本征绿色），此时激光照射非必需；但在低浓度或无明显比色信号时，激光照射可揭示热印记，显著提高检测灵敏度。

**2.2 AuNPrs的合成、纯化与生物功能化**
AuNPrs采用改进的无种子法合成，在静态或可控温度搅拌条件下进行，获得LSPR峰在1100-1200 nm附近的纳米棱镜。通过超速离心初步去除球形副产物，再经聚乙二醇（PEG）修饰以提高胶体稳定性和提供羧基，最后通过琼脂糖凝胶电泳进一步纯化。对于ThermoLFIA，AuNPrs（AuNPrs:PEG质量比1:1）通过EDC/sulfo-NHS化学与链霉亲和素共价结合，最佳链霉亲和素浓度为10 µg mL^-1，结合效率约56%（约1626个链霉亲和素分子/纳米棱镜）。随后与生物素化抗体（抗CEA、抗CA19-9或抗VEGF）孵育，最佳抗体浓度为12 µg mL^-1，结合效率约50%（约360个抗体分子/纳米棱镜）。对于ThermoOLFA，使用更高的PEG比例（1:2）以钝化表面，然后通过相同化学方法偶联氨基修饰的PPRH检测探针。在22 µg mL^-1探针浓度下，功能化效率约65%（约715个寡核苷酸/纳米棱镜）。功能化后，纳米颗粒保留负的Zeta电位和稳定的胶体特性，且光热性能未受显著影响。

**2.3 ThermoLFIA检测胃肠道癌标志物**
ThermoLFIA系统的优化涉及试纸条组件（膜、垫）、试剂浓度、激光参数等多个变量。最终选择FF80HP硝酸纤维素膜，并优化了结合垫的预处理条件（使用含蔗糖、BSA、Tween-20和PVP的硼酸缓冲液）。使用1064 nm NIR激光照射检测线（功率1.5 W，曝光2或4分钟），热敏纸产生热印记，其灰度强度用于定量。系统对三种生物标志物的性能如下：对于CEA，在0-10 ng mL^-1范围内线性响应（R² > 0.9），LoD为2 ng mL^-1，定量限（LoQ）为7 ng mL^-1；对于CA19-9，采用Hill模型拟合，LoD为5 U mL^-1（5 ng mL^-1），LoQ为17 U mL^-1；对于VEGF，LoD为300 pg mL^-1（0.3 ng mL^-1），LoQ为500 pg mL^-1。所有LoD均低于相应的临床诊断阈值。传感器的响应效率（归一化灵敏度）分别为CEA ~5%每 ng mL^-1，CA19-9 ~2%每 ng mL^-1，VEGF ~24%每 ng mL^-1，显示了中等到高的响应性。在50%人血浆基质中（含10% Tween-20），通过优化预处理，系统仍保持与PBS中相当的分析性能（例如，在血浆中CEA的LoD为2.34 ng mL^-1 vs PBS中2.09 ng mL^-1）。

**2.4 ThermoOLFA检测SARS-CoV-2**
ThermoOLFA的优化集中在膜选择、缓冲液成分、样本体积和杂交效率上。采用预孵育步骤：将样本（25 µL）与AuNPrs生物偶联物、生物素化捕获探针和运行缓冲液（PBS 10×，含0.5% BSA和1% Tween-20）混合孵育后上样。激光照射参数优化为1.2 W，60秒。在缓冲液中，系统LoD为1.32 pM，LoQ为2.67 pM，线性良好（R² > 0.9）。在UTM中，LoD改善至0.7 pM（约1.0×10⁷病毒RNA拷贝/25 µL）。扫描电子显微镜（SEM）背散射电子成像证实了靶标存在时检测线上纳米颗粒的积累。特异性验证显示，针对流感A/B和大肠杆菌的探针无交叉反应。与现有方法比较，ThermoOLFA无需核酸扩增、酶、温度循环或专业人员，操作简便（15-25分钟），成本低廉（每测试<1欧元），且灵敏度可与RT-qPCR（Ct 35）相媲美。对104份临床样本的验证（使用便携式原型机在约0.6 W下照射）显示，ThermoOLFA正确分类了所有样本：54例真阳性（TP），2例假阳性（FP），1例假阴性（FN），47例真阴性（TN）。计算得出敏感性98.2%（54/55），特异性95.9%（47/49），PPV 96.4%，NPV 97.9%，总准确率97.1%。特别值得注意的是，所有13份Ct > 32（最高35.4）的低病毒载量样本均被正确检出，显示出与RT-qPCR相当甚至更高的检测灵敏度。该平台在成本、速度和操作简便性方面相比其他已验证的快速检测方法具有优势，适合用于分散化部署和大规模筛查。

**总结讨论**
本研究开发并成功实施了一种即时检测（POC）生物传感平台，该平台结合了传统侧流系统的简便性和等离子体纳米颗粒的独特能力，其热转导特性是关键使能元素。这些AuNPrs能高效吸收近红外光并将其转化为局部热量，作为灵敏的热标记物增强检测线的信号。该平台作为概念验证平台，展示了热等离子体读取模式在两种不同应用（ThermoLFIA检测癌症蛋白标志物，ThermoOLFA检测病原体核酸）中的通用性。从ThermoLFIA到ThermoOLFA的演进凸显了该方法在通用平台内支持不同生物识别策略的潜力。其固有的模块化和适应性，通过结合热敏纸读取、可调谐的金纳米棱镜和可定制的生物识别元件，使系统能够适应广泛的靶标。尽管要完全转化为可部署的诊断工具（包括试剂稳定性、设备集成、大规模验证和监管批准）仍需进一步工作，但本文的结果为此奠定了坚实基础。该平台代表了将纳米等离子体传感概念整合到实用诊断形式中向前迈出的一步，具有在即时检测和分散化检测场景中应用的潜力。

**研究结论**
研究人员开发并成功实施了一种即时检测（POC）生物传感平台，该平台结合了传统侧流系统的简便性和等离子体纳米颗粒的独特能力，其热转导特性是关键使能元素。这些纳米结构经过高重复性合成以及严格的物理化学和光学表征，能够高效吸收近红外（NIR）光并将其转化为局部热量，使其能够作为灵敏的热标记物，在检测线实现增强的信号生成。该生物传感器作为概念验证平台，将纳米颗粒的独特性质应用于两个不同的系统：用于检测与胃肠道癌相关蛋白质生物标志物的ThermoLFIA，以及用于检测SARS-CoV-2等病原体遗传物质的ThermoOLFA。这些例子说明了该方法的多功能性，可以轻松适应其他相关靶标。金纳米棱镜作为热标记物最初通过手动合成，后来通过部分方案自动化进行规模化，实现了更大体积的可重复生产。合成后进行了详细的物理化学和光学表征，随后的生物功能化也具有良好的重复性。通过将侧流条与高灵敏度热敏纸耦合，引入了信号放大的额外维度。在这种配置下，由于分析物浓度低而在常规目视检查下无法检测到的检测线，在近红外照射后能够通过热成像显现。为了解决照射可能带来的安全问题，进一步设计了一款紧凑且经济的原型设备，通过保护外壳和集成光学元件确保对测试条进行受控和安全的近红外照射。此外，与紧凑、用户友好的光学读取器兼容的侧流试纸盒的集成，显著提高了可重复性、便携性和易用性。在此系统中，热信号通过受控的近红外激光照射测试条产生，而光学读取器则实现对热响应的独立定量评估。这些组合特性有助于提高分析性能、简化读取并增强传感平台的稳健性。总体而言，热等离子体读取能够在快速、低成本的侧流格式中可靠地检测所测试癌症生物标志物的临床相关浓度。重要的是，该平台可以扩展到临床SARS-CoV-2样本中无需扩增的病毒RNA检测，包括低病毒载量病例（Ct > 35），同时与传统的基于实验室的免疫测定或核酸扩增方法（如PCR）相比，保持了更简单的操作流程。该平台展示了对不同生物识别策略的通用性，证明了其在胃肠道癌生物标志物和SARS-CoV-2核酸检测中的临床相关性能。该平台的模块化和适应性使其能够快速开发针对新兴威胁、慢性疾病或个性化诊断的检测方法。尽管要完全将该方法转化为可部署的诊断工具（包括试剂稳定性、设备集成、大规模验证和监管批准）仍需进一步工作，但本文展示的结果为此奠定了坚实的基础。在此背景下，该平台代表了将纳米等离子体传感概念整合到实用诊断形式中向前迈出的一步，具有在即时检测和分散化检测场景中应用的潜力。