摘要
1 引言
抗微生物耐药性（AMR）已成为21世纪全球卫生安全面临的深刻且不断加剧的威胁。文中指出，依据发表于《柳叶刀》的纵向预测，至2050年，与AMR相关的全球年度死亡人数预计将达到822万。铜绿假单胞菌被世界卫生组织（WHO）列为“优先级1：关键”病原体，反映出其较高的疾病负担与强大的耐药谱。临床上，该菌是医疗相关感染的重要病原体，可引发呼吸机相关性肺炎、导尿管相关尿路感染等，并在易感患者中迅速进展；同时，它也是囊性纤维化患者慢性肺部感染的核心病原。
文章进一步阐述，铜绿假单胞菌的治疗困难源于其兼具内在性与获得性耐药机制。内在耐药主要与外膜低通透性、染色体编码的AmpC β-内酰胺酶以及多药外排系统有关；获得性耐药则涉及靶位突变、孔蛋白通透性下降、外排泵失调及额外耐药基因的水平获得。更为关键的是，越来越多证据表明，生物膜形成可进一步提高其对抗菌药物及宿主免疫防御的耐受性，从而削弱妥布霉素、环丙沙星等常规治疗的清除效果。即便药物能够降低生物膜内活菌数量，也常难以根除已建立的生物膜，残存细菌因此得以持续存活并再生长，推动慢性感染并导致囊性纤维化患者预后不良。
在结构层面，铜绿假单胞菌通过分泌由胞外多糖Pel、Psl、藻酸盐、胞外DNA（eDNA）、蛋白质及脂质构成的胞外基质，将自身包埋于生物膜体系中，形成限制抗生素渗透并促进代谢异质性的物理与生理屏障。文中指出，与浮游细胞相比，生物膜内细胞往往需要高出10–1000倍的抗生素浓度方能实现抑菌或杀菌效应。由于生物膜内部存在氧与营养梯度、局部低氧、氧化还原应激及生长减缓等微环境特征，持留细胞更易富集，并可诱导应激反应程序，使基于生物膜的药敏试验中最低抑菌浓度（MIC）及最低生物膜清除浓度（MBEC）升高。与此同时，基质本身还可滞留抗生素并诱导治疗耐受。文章强调，生物膜发育受群体感应（QS）、双组分调控系统以及第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）精细调控，这些通路共同协调毒力表达与结构成熟，因此生物膜介导耐药性要求临床重新审视给药策略与治疗范式。
在此背景下，治疗创新逐渐转向抗毒力与抗生物膜策略，即通过“解除致病性”而非单纯“杀灭病原体”来改善疗效。文中列举了多类有前景的策略，包括QS抑制剂、c-di-GMP调节剂、噬菌体治疗、抗菌肽、纳米颗粒、单克隆抗体及疫苗。这些方法旨在破坏生物膜完整性、增强抗生素渗透并恢复宿主免疫清除，从而克服传统抗菌药物的局限性。然而，铜绿假单胞菌高度的抗原变异性与遗传可塑性，仍然限制了广谱而稳定的治疗效果。
作者据此提出研究必要性：随着该领域研究数量迅速增长，有必要通过系统方法描绘其知识结构、主题演化及合作网络。文献计量学可通过发文趋势、引文网络、关键词共现及机构贡献的量化分析，识别研究热点、前沿方向与知识空白。尽管已有多篇综述总结了铜绿假单胞菌生物膜的生物学及临床特征，但缺乏针对“生物膜介导耐药”这一主题的综合性文献计量研究。因此，本研究旨在通过可视化、数据驱动的方法，对全球铜绿假单胞菌生物膜介导耐药研究进行系统性描绘。
2 材料与方法
2.1 文献计量分析的检索策略
研究人员于2025年12月20日在Web of Science Core Collection（WoSCC）和Scopus数据库中开展系统检索，以提升数据覆盖度并减少单一数据库偏倚。检索策略围绕铜绿假单胞菌、抗微生物耐药性与生物膜三大核心主题构建，时间范围限定为2014–2025年，语言限定为英文。作者指出，这一英文限制可能带来语言偏倚，但鉴于英文是国际生物医学出版的主导语言，且WoSCC与Scopus主要收录英文记录，因此整体文献计量格局预计不会受到实质性影响。
初始检索获得WoSCC文献3,955篇、Scopus文献5,209篇。出于文献计量目的，研究同时保留原创性研究论文与综述论文，因为前者代表初级知识生产，后者体现证据整合、研究议程设定与知识凝练。经初筛后，保留WoSCC记录3,903篇、Scopus记录4,907篇，随后利用Python去重，最终纳入6,537篇文献用于分析。文献学信息及被引参考文献数据被导入VOSviewer 1.6.18、CiteSpace 6.2.R2和bibliometrix R包5.0进行后续分析与可视化。
2.2 补充性临床试验综述
为增强文献计量结果的临床转化解释力，研究人员进一步开展了基于PubMed的已发表临床研究叙述性综述，并利用ClinicalTrials.gov构建已注册试验的格局概览。与文献计量检索不同，该部分聚焦铜绿假单胞菌与生物膜相关临床研究的交叉领域。PubMed检索同样覆盖2014–2025年，并限定研究类型为临床试验，以提高对临床导向生物膜研究的检出敏感性，因为许多干预研究的题名或摘要未必明确包含“抗微生物耐药性”术语。该检索获得18条临床试验记录。与此同时，ClinicalTrials.gov以“Pseudomonas aeruginosa”为条件词、限定为干预性研究进行检索，共获得68项注册临床试验。
研究团队依据预设的、参考PICOS框架的纳入排除标准，对两部分检索所得记录的题目、摘要及注册信息进行人工筛选。纳入标准包括：以人类受试者为对象的临床试验或前瞻性干预研究；涉及铜绿假单胞菌感染、定植或在生物膜相关场景中的临床相关检测；并评价对临床结局、微生物负荷、生物膜组成或生物膜相关治疗反应有影响的干预措施。排除标准包括非人类或兽医研究、缺乏患者层面数据的环境或工程研究、无干预的观察性研究、纯体外实验研究，以及未将铜绿假单胞菌或生物膜作为核心临床组成部分的研究。筛选后，排除PubMed记录12项和ClinicalTrials.gov记录50项。最终纳入6项已发表临床研究用于补充性叙述综述，另纳入18项注册干预性试验用于试验格局概述。已发表研究进一步采用与研究设计相匹配的工具进行方法学质量与偏倚风险评价，而注册试验由于并非同行评议临床结局证据，因此未进行正式偏倚风险评估。
3 结果
3.1 发文趋势分析
基于合并后的WoSCC–Scopus数据集（n = 6,537），该领域2014–2025年的研究产出呈持续上升趋势，累积发文曲线显示出明显加速，提示铜绿假单胞菌生物膜介导耐药已成为快速扩展的研究方向。
3.2 国家分析
全球研究格局中，中国（1,081篇）、美国（1,030篇）与印度（937篇）是发文量最高的三个国家。中心性分析显示，美国的中介中心性最高（0.47），其后为印度（0.14），英国与意大利也表现出较显著的桥梁作用（均为0.12）。文章指出，美国多国合作论文（MCP）占比更高，说明其在国际协作网络中处于更强的枢纽位置；而中国虽产出高，但单国论文（SCP）占比较高，反映其研究活动更偏向国内集中。
3.3 机构分析
机构合作网络显示，Egyptian Knowledge Bank位居研究网络中心，在发文频次（167篇）与中介中心性（0.22）方面均排名首位。Islamic Azad University与Chinese Academy of Sciences等高产机构也呈现出重要结构性影响。整体机构共现图显示，该领域已形成一个联系较为紧密的全球研究生态，其中既有Harvard University、Copenhagen University Hospital等成熟学术实体，也有新兴研究团队共同推动铜绿假单胞菌生物膜耐药研究的发展。
3.4 作者分析
作者层面显示，该领域具有较强的合作性与较高的学者产出。Hancock, Robert E. W.以29篇文献位居总发文量前列，Khan, Fazlurrahman以27篇紧随其后。被引影响力方面，Hancock, Robert E. W.与Ciofu, Oana分别以2,955次和2,260次引用构成该领域的重要知识支柱。共著网络表明，该领域并非单中心结构，而是由多个联系紧密的研究集群共同构成，覆盖机制研究、临床研究与生物技术研究等不同方向。
3.5 期刊分析
该研究主题分布于1,396种不同来源期刊中，其中《Frontiers in Microbiology》为最主要的发文期刊，共发表379篇文献，累计被引18,250次，同时具有最高的h指数（66）。主要活跃期刊的影响因子大致在3.3至4.9之间，说明该领域研究主要发表于具有中等至较高学术影响力的期刊。
3.6 关键词分析
基于关键词共现网络、时间线聚类、词云及突现词分析，文章将铜绿假单胞菌生物膜耐药研究归纳为三个核心方向：其一，多重耐药（MDR）演化与致病协同；其二，新型抗菌干预与功能材料；其三，临床转化与疗效评价。时间演化上，该领域呈现较清晰的阶段性变化。2014–2018年，“囊性纤维化”为高强度突现关键词，标志着以慢性感染临床相关性为核心的奠基阶段。2016–2022年，研究重点逐步转向机制与治疗挑战，“抗生素耐受”“群体淬灭”“一氧化氮”“抗菌药物敏感性”等成为重要信号，反映出对耐药调控、QS干预和抗生物膜靶点的深入探索。至2023–2025年，“绿色合成”和“紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）”成为前沿关键词，提示研究正向可持续制备策略、天然来源抑制剂及创新材料治疗方向延伸。
3.7 临床试验分析
在18条PubMed临床试验记录中，最终仅6项研究被判定为与铜绿假单胞菌生物膜相关临床研究直接相关，主要分布于三类场景：慢性创面、导管相关血流感染以及囊性纤维化气道感染。研究设计以随机试验或交叉试验为主，另含1项前瞻性I/II期单臂干预研究。方法学质量评估显示，2项随机试验偏倚风险较低，3项随机或交叉研究存在一定疑虑，单臂前瞻性研究的方法学质量为一般，说明已发表临床证据总体仍处于探索阶段。
除已发表研究外，ClinicalTrials.gov中另识别出18项与铜绿假单胞菌生物膜相关感染有关的注册干预性试验。这些研究主要集中于慢性肺部感染，尤其是囊性纤维化与非囊性纤维化支气管扩张，同时涉及手术部位感染、压疮、糖尿病足溃疡、烧伤创面及医院获得性肺炎预防。干预策略以非传统抗铜绿假单胞菌方案为主，特别是噬菌体治疗，同时包括生物膜或毒力靶向单克隆抗体、吸入型一氧化氮制剂以及镓基治疗等。18项注册研究中，10项已完成或研究完成，3项正在招募，1项由申办方终止，4项处于状态不清、逾期或信息陈旧状态。综合来看，注册试验格局表明该领域正明显向辅助性、机制靶向型转化干预拓展，但许多干预措施仍缺乏成熟疗效数据。
4 讨论
4.1 总体分析
本文通过将文献计量分析与已发表临床试验及注册干预性研究的补充性综述相结合，系统刻画了铜绿假单胞菌生物膜介导耐药研究的知识结构与转化轨迹。2014–2025年间，该领域围绕三个彼此关联的主题持续扩展：MDR演化与致病协同、新型抗菌干预与功能材料、临床转化与疗效评价。国家、机构和作者层面的结果表明，这已是一个成熟且高度多学科交叉的研究领域。美国在国际协作中充当最强桥梁，中国与印度则贡献了最大规模的发文量。知识谱系层面，Hancock、Khan与Ciofu等学者分别代表了抗生物膜材料、抗菌肽及生物膜条件下耐药适应等相互补充的研究计划。
作者进一步指出，本研究的一个重要优势在于，文献计量结构并非停留于抽象关键词聚类，而是能与代表性文献脉络相对应。例如，由Khan主导的研究群主要聚焦纳米颗粒，如Au、Ag与ZnO在生物膜抑制中的应用；Hancock相关研究群强调合成抗生物膜肽与聚合物工程化开发，以及评价方法标准化；Ciofu与Hoiby研究群则关注抗生素压力下铜绿假单胞菌的进化适应，突出显示生物膜在驱动AMR中的关键地位。这说明该领域不仅按主题组织，也按相对稳定的转化研究议程进行演进。
4.2 铜绿假单胞菌生物膜介导耐药的研究热点
关键词分析的多维结果共同指向三个主方向，显示该领域已从核心耐药机制界定，推进至抗生物膜策略开发及其临床适用性检验。文章随后围绕这三类结果导向的主题展开讨论。
4.2.1 MDR演化与致病协同
MDR相关关键词的突出地位表明，耐药演化仍是该领域的机制核心。文章总结指出，铜绿假单胞菌生物膜内MDR的形成，是由染色体突变、水平基因转移（HGT）与微环境应激共同驱动的协同过程。生物膜特异性通路如RpoS介导的静止期反应及Anr调控的低氧应激，可促进对环丙沙星的快速耐药。在亚抑制浓度抗生素压力下，生物膜基质推动低水平突变性耐药的累积，且体内环丙沙星耐药可在第二代即出现，涉及nfxB、mexZ与parS等基因突变。因此，抗生素耐受、持留细胞与药敏变化等时间信号并非孤立现象，而是生物膜环境下动态生存状态的表现。
HGT则为耐药扩散提供另一机制解释。文中提到，生物膜来源外膜囊泡可作为DNA受保护载体，促进高密度细菌群体内质粒转移；IncP-2型质粒可携带多种耐药基因组合，扩大耐药表型。噬菌体介导HGT同样值得关注，最新研究显示其可促进mexT、mexR、nfxB等外排泵调控基因的横向传播。
此外，关键词格局还揭示了多菌种生物膜中的致病协同效应。种间相互作用可通过代谢物交换、QS信号及生物膜结构改变调节抗菌药物敏感性，通常降低治疗效果。铜绿假单胞菌可通过PA1396组氨酸激酶感知可扩散信号因子，进而改变生物膜结构并提高耐受性。文中还指出，热带念珠菌上清液可上调铜绿假单胞菌aph(3’)-IIb和gyrA等基因，增强其对氨基糖苷类和氟喹诺酮类的耐药。囊性纤维化环境中，生物膜基质阻碍抗生素扩散，而MexAB-OprM与MexCD-OprJ等外排系统同时参与生物膜形成与阿奇霉素耐药。营养竞争导致ATP耗竭，也可进一步增强抗生素耐受。尤其在铜绿假单胞菌–金黄色葡萄球菌共生物膜中，AmpC β-内酰胺酶、胞外多糖Psl和Pel，以及LasR和RhlR等QS调控因子可共同保护金黄色葡萄球菌免受β-内酰胺类药物杀伤。整体而言，这些结果表明，铜绿假单胞菌生物膜介导耐药 increasingly 被理解为一种适应性、群落层级且受生态调控的过程，而非单菌种、单基因型耐药表型。
4.2.2 新型抗菌干预与功能材料
第二大方向是新型抗菌干预与功能材料开发。文章指出，有效干预通常需同时破坏基质屏障、提高局部药物渗透、干扰细菌通讯，或将抗菌作用与组织修复相结合。壳聚糖基抗菌水凝胶与静电纺丝纤维敷料，是面向铜绿假单胞菌生物膜相关创面感染的重要材料路径。壳聚糖中质子化氨基可通过静电作用与带负电的细菌膜结合，造成膜损伤与胞内物质泄漏。通过化学交联或物理共混，壳聚糖水凝胶可获得持续释放、pH响应、光响应、抗菌、抗炎及促血管生成等多功能。代表性研究已将银纳米颗粒、松萝酸、铜离子、生长因子等整合于此类体系，以实现细菌控制与创面修复的协同。静电纺丝膜则因其高孔隙率、大比表面积及类细胞外基质结构，适用于感染创面敷料构建。壳聚糖/明胶膜、小檗碱负载醋酸纤维素/明胶敷料及季铵化壳聚糖修饰纤维等，均显示出对铜绿假单胞菌感染模型的抗菌或促愈合作用。
纳米技术相关研究则解释了“抗生物膜剂”“抗菌活性”“绿色合成”等术语的重要性。银纳米颗粒（AgNPs）可通过膜相互作用、膜破坏及活性氧（ROS）生成发挥抗菌作用，其对铜绿假单胞菌的MIC通常为1–200 μg/mL。表面功能化可显著调节其抗生物膜性能，且AgNPs与妥布霉素或氨曲南联用时可通过增强生物膜穿透及膜损伤而产生协同。氧化锌纳米颗粒（ZnONPs）则通过静电作用、锌离子释放和ROS生成抑菌，在亚抑制浓度下即可显著抑制生物膜形成并下调QS基因表达。ZnO-Ag纳米复合物则综合两者优势，通过膜损伤与氧化应激显著破坏成熟生物膜。近年来“绿色合成”的突现也提示，植物介导纳米颗粒制备正成为当前前沿，将天然来源抑制剂与环境友好型抗菌材料开发相结合。
药物递送系统进一步展示了传统抗生素如何被重新定位于工程化抗生物膜平台中。针对eDNA在生物膜中的保护作用，研究已开发出DNase I功能化纳米颗粒，可通过降解基质支架并控制释放环丙沙星，实现对成熟生物膜超过99.8%的清除。聚合物纳米颗粒还可借助化学屏蔽、电荷反转及磁场或超声辅助运输提高递送效率。文中举例，PEG化妥布霉素可增强其在生物膜中的穿透能力，疗效可达游离妥布霉素的7倍。
生物学靶向干预，尤其是抗菌肽（AMPs）及QS相关抑制剂，则构成另一条机制导向路径。AMPs能够破坏膜电位、 destabilize 胞外基质成分，并下调lasR、rhlR等QS基因表达。宿主防御肽及其工程化变体依赖高阳离子性和两亲性穿透复杂生物膜并清除嵌入菌体。基于银、聚合物或多孔硅的AMP纳米递送系统可增强膜通透性并抑制外排泵表达。AMPs与常规抗生素联用还可降低MBEC，并在囊性纤维化气道等复杂生理条件中保持较高活性。整体上，这一聚类结果提示，未来抗生物膜治疗可能越来越依赖多功能平台，而非单一药物的抗菌活性。
4.2.3 临床转化与疗效评价
第三大方向是临床转化与疗效评价。文献计量信号与补充性临床研究综述相互印证，表明该领域已开始超越机制和材料层面的前临床探索，但临床证据成熟度明显低于基础研究。已发表的6项相关干预研究主要集中于慢性创面、导管相关血流感染及囊性纤维化气道感染。在慢性创面中，银离子亲水纤维敷料、胶原酶软膏和富血小板血浆等辅助策略可改善临床或微生物学指标，但干预间未见明确优越性。在导管相关血流感染中，庆大霉素–EDTA封管治疗取得较有利的临床和微生物学治愈率。在囊性纤维化慢性感染方面，吸入用脂质体阿米卡星悬液在肺功能改善上不劣于妥布霉素吸入液，而基于生物膜药敏试验指导的抗生素治疗并未优于常规药敏指导治疗。另有一项试点性交叉研究提示，提高肺内叩击通气频率可能干扰生物膜相关细菌行为并改善肺功能。由此可见，该领域虽已进入临床试验阶段，但尚未形成稳固临床证据体系。
注册试验数据则扩展了这一转化图景。尽管许多干预尚缺乏成熟疗效结果，注册试验管线已显示该领域明显超出传统抗生素比较的范畴，尤其向慢性肺部感染聚焦，并广泛布局噬菌体、生物膜或毒力靶向单克隆抗体、吸入型一氧化氮及镓基疗法等非传统方案。作者强调，临床研究势头并不等同于临床证据确立。即使若干研究已标注完成，很多仍未产生成熟的同行评议疗效数据，且部分试验被中止或状态不清。因此，当前转化管线更适合被理解为“广泛拓展”而非“充分成熟”。
4.3 局限性
文章最后指出，本研究存在若干固有限制。首先，文献计量分析主要依赖WoSCC与Scopus，PubMed和ClinicalTrials.gov仅用于补充性临床试验综述，因此其他数据库收录的相关研究可能被遗漏。其次，排除非英文文献可能带来地域与语言偏倚。再次，引文指标受引文时滞影响，2024–2025年的文献尚未充分体现其学术影响。最后，文献计量映射可识别主题结构与合作网络，但无法直接评价文中讨论抗菌策略的生物学或临床疗效。
5 结论
总体而言，本研究对2014–2025年全球铜绿假单胞菌生物膜介导耐药研究进行了系统性的文献计量学概述，并辅以已发表临床研究与注册干预试验的补充性分析。结果表明，该领域持续增长，并逐渐形成“耐药演化与致病协同—新型抗生物膜干预—临床转化”三大主线。尽管转化研究，尤其在慢性气道感染与伤口相关感染中明显扩展，但高质量、成熟的临床证据仍然有限。尽管受数据库覆盖、引文时滞、语言或索引偏倚以及文献计量方法描述性特征等因素限制，本研究仍较为清晰地勾勒了该领域的知识结构、研究热点与新兴趋势，可为后续抗生物膜与抗耐药策略研究提供有价值的参考。
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