识别靶向分枝杆菌属关键酶的配体仍然是抗结核药物发现的重要策略。本研究采用天然质谱（native MS）方法，使用100个化合物的混合物池，能够直接检测溶液中完整的6-羟甲基-7,8-二氢蝶呤焦磷酸激酶（HPPK）-配体复合物。双模式质谱采集（低碰撞能用于复合物检测，高碰撞能用于配体确认）结合自动化数据分析工作流程，确保了从这些复杂样品中稳健地识别结合事件。该策略鉴定出若干HPPK结合小分子，均属于达玛烷型三萜糖苷（人参皂苷）类。对命中化合物的后续分析揭示了明确的结构-亲和关系，突出了特定苷元修饰和糖基化模式如何影响与HPPK的结合。研究人员的研究结果扩展了已知的HPPK配体化学空间，并展示了基于天然质谱筛选结合自动化数据分析在发现针对挑战性酶靶点的新配体骨架方面的实用性。
**论文解读：双模式天然质谱筛选鉴定HPPK的人参皂苷配体**
结核病（Tuberculosis, TB）仍然是全球健康紧急事件，耐多药结核菌的兴起使开发新疗法迫在眉睫。分枝杆菌的叶酸生物合成途径是重要药物靶点，其中6-羟甲基-7,8-二氢蝶呤焦磷酸激酶（HPPK）催化关键步骤，且无人类同源物，但此前该酶未被充分探索。天然产物具有丰富的化学多样性，但传统高通量筛选效率低、成本高且易出现假阳性。天然质谱（native MS）可直接观测非共价蛋白-配体复合物，结合混合物池筛选可加速配体发现。本研究针对耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）HPPK，建立了双模式天然质谱筛选方法，从天然产物库中鉴定配体，旨在发现新化学骨架并解析结构-亲和关系。论文发表在《Molecules》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用了双模式天然质谱（dual-mode native MS）工作流程：低碰撞诱导解离（low CID, 10 V）用于检测完整蛋白-配体复合物，高CID（25–30 V）用于释放配体离子以进行确认。基于Python开发了自动化数据分析流程，处理19个化合物池（每池最多100个化合物，来自Quinn-Liu天然产物库，共约1890个化合物，由Compounds Australia提供）。使用Bruker SolariX FT-ICR质谱仪进行筛选，Thermo Q Exactive UHMR用于个体验证。样本制备包括真空干燥去除二甲基亚砜（DMSO）、甲醇复溶并与HPPK（10 µM）孵育1小时。
**研究结果**
**2.1 双模式天然质谱工作流程**
为鉴定靶向HPPK的配体，研究人员应用了基于天然质谱的筛选方法，对内部天然产物库进行了筛选。该文库由1890个化合物组成，分子量主要分布在200–800 Da，且结构多样性高。化合物被随机分为19个池（每池最多100个化合物）。在对重组M. smegmatis HPPK进行天然质谱分析时，蛋白质呈现以7+和8+电荷态为中心的窄分布，去卷积质量为20,205 Da，与理论值一致，表明其保持折叠构象。使用已知HPPK配体8-巯基鸟嘌呤（8-mercaptoguanine, 8-MG）作为阳性对照，成功观测到完整的HPPK–8-MG复合物，并通过滴定实验估算解离常数（K
d）约为16.2 µM。为应对100-化合物混合物池中弱信号和离子抑制，开发了双模式采集策略：低CID（10 V）保留完整复合物以检测结合事件并估算相对亲和力；高CID（25–30 V）诱导配体释放，产生单电荷离子以提高信噪比，实现配体鉴定。两种模式结合，可在复杂样品中实现配体检测与确认。
**2.2 自动化数据分析**
为处理高通量筛选产生的大量数据，研究人员实施了一套基于Python的自动化数据分析流程。首先，对低CID和高CID质谱数据进行峰拾取、转换和谱图对齐。在低CID数据中，基于去卷积蛋白质量识别HPPK电荷态，检测蛋白-配体复合物新峰，并计算质量差（±2 Da容差）匹配配体数据库。仅当质量偏移在两个及以上电荷态中一致出现时视为结合事件。在高CID数据中，基于低CID结果预测配体加合物（[M+H]
+、[M+Na]
+、[M+K]
+）的m/z值，并搜索对应峰以确认配体身份。该流程支持批量处理、结合比计算和结果可视化。
**2.3 筛选结果**
使用双模式天然质谱筛选工作流程结合自动化数据分析，研究人员从天然产物库中鉴定出14个形成HPPK-配体复合物的配体，结合比阈值设为1%（低CID数据）。以0.25%的命中率，选取前5个作为主要命中：伪人参皂苷F11（pseudoginsenoside F11）、人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1）、人参皂苷F3（ginsenoside F3）、人参皂苷Re（ginsenoside Re）和人参皂苷Rb3（ginsenoside Rb3），均属于人参皂苷家族。其中伪人参皂苷F11结合比最高（约2%），其余结合比在1.0%–1.5%之间。
**2.4 命中验证**
对上述5个命中及额外20个人参皂苷进行个体验证（蛋白:配体=1:2.5）。所有5个命中的结合比在个体验证中均高于混合池筛选，其中人参皂苷F3增强最显著（从约1%增至12.49%）。在全部25个测试化合物中，结合比最高的是(S)-人参皂苷Rh1（14.40%）和人参皂苷Rg2（13.66%），其次为人参皂苷F3（12.49%）、人参皂苷Rf（11.35%）和人参皂苷F1（10.08%）。所有高亲和力配体均属于原人参三醇（protopanaxatriol, PPT）亚类。结构-活性关系分析显示：PPT型（C-6有羟基或糖苷取代）结合显著强于原人参二醇（protopanaxadiol, PPD）型（C-6无氧）；糖基化程度较低（1–2个糖）的配体结合更强；结合比与计算脂水分配系数（cLogP）呈中间范围偏好（2.1–4.0）；C-20构型也影响结合，(S)-构型远强于(R)-构型（如(S)-人参皂苷Rh1比(R)-型强3.1倍）。7个未检测到结合的配体多为PPD型或高cLogP值。
**结论与讨论**
研究人员指出，双模式天然质谱筛选从天然产物库中成功鉴定了人参皂苷类HPPK配体，并揭示了清晰的结构-结合关系：C-6氧取代、低糖基化、(S)-C-20构型及中等疏水性有利于结合。尽管这些化合物表现出结构依赖的结合，但在高达100 µM浓度下未显著抑制M. smegmatis生长，可能与ATP竞争、细胞渗透性差或催化机制高度的优化有关。这些发现扩展了HPPK配体的已知化学空间，证明基于天然质谱的筛选能发现结构一致的配体类别，并为理解分子识别过程提供了见解。未来结合表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）等方法将有助于精确定义结合模式和亲和力。
