单细胞层面解析乳腺癌循环肿瘤细胞上皮-间质转化异质性及其临床意义

本文推荐一篇关于乳腺癌循环肿瘤细胞（CTCs）上皮-间质转化（EMT）异质性的重要研究。作者采用多标记免疫荧光（EpCAM、E-cadherin、MCAM、csVIM）结合单细胞转录组测序技术，在107例乳腺癌患者中发现EMT表型异质性与淋巴结转移、肿瘤大小及分子亚型显著相关。研究首次揭示CTCs中核糖体基因下调与mTORC1信号通路的联系，为靶向CTCs播散脆弱性提供了新见解。

引言

乳腺癌（BC）作为女性最常见的恶性肿瘤，其远处转移主要由循环肿瘤细胞（CTCs）通过血液和淋巴系统播散所致。CTCs表现出显著的表型异质性，其中上皮-间质转化（EMT）是导致这种异质性的关键因素。EMT赋予肿瘤细胞增强的迁移能力、抗凋亡能力和干细胞特性，但同时也因上皮标志物（如EpCAM、E-cadherin）下调而给CTCs检测带来挑战。本研究旨在通过多标记免疫荧光技术与单细胞转录组学相结合，系统解析乳腺癌CTCs的EMT异质性及其临床意义。

材料与方法

研究纳入107例乳腺癌患者（104例早期患者），通过免疫磁珠去除造血细胞（CD45⁺）和内皮细胞（CD31⁺），采用多标记免疫荧光 panel（EpCAM、ECAD、MCAM、csVIM）鉴定CTCs的表型：上皮型CTCs（eCTCs）、上皮-间质混合型（emCTCs）和间质型（mCTCs）。通过微操作分离单细胞后，使用Smart-Seq2方法进行全转录组扩增，并进行RNA测序和qPCR验证。统计分析采用Poisson回归模型评估临床病理特征与CTCs表型的关联。

结果

3.1 方法学验证

spike-in实验显示MCF-7（上皮模型）和MDA-MB-231（间质模型）细胞的回收率分别为58.4%和66.6%，PBMCs去除率达98.4%。单细胞转录组质量评估表明，89% MCF-7和100% MDA-MB-231细胞可检测到至少2个看家基因表达。

3.2 CTCs表型异质性

51.9%的早期乳腺癌患者检测到CTCs，其中仅含eCTCs者占3.8%，仅mCTCs者占26.0%，仅emCTCs者占5.8%，16.3%患者存在多种表型混合。三阴性乳腺癌（TNBC）患者中86%存在多表型CTCs，显著高于Luminal A型（17%, P=0.008）。

3.3 临床病理关联

淋巴结阳性（cN^pos）患者所有CTCs表型数量显著增加（eCTCs: IRR=14.1, P<0.001；mCTCs: IRR=2.85, P<0.001）。肿瘤大小（cT_2-4）与mCTCs数量正相关（IRR=2.2, P<0.001），小叶癌与emCTCs/mCTCs减少相关。ER阴性患者CTCs数量显著高于ER阳性者（4 vs 0, P=0.005），HER2阳性患者mCTCs数量更高（1 vs 0, P=0.024）。

3.4 转录组学特征

true CTCs（tCTCs）与正常细胞（tNCs）比较显示471个基因下调，主要涉及核糖体蛋白（RPL15, RPL6, RPS11等）和翻译相关通路。唯一显著上调的基因包括翻译抑制因子CYFIP1和组蛋白去甲基化酶KDM3B。验证数据集（GSE109761）分析证实：eCTCs中mTORC1信号通路激活（NES=1.43, P=0.002），而mCTCs中该通路抑制（NES=-1.33, P=0.053）。eCTCs中mTORC1复合物基因（MTOR, RPTOR, MLST8）和应激转录因子ATF4表达显著高于mCTCs。

讨论

本研究首次在早期乳腺癌患者中系统描绘了CTCs的EMT表型全景，发现淋巴结转移是所有CTCs表型播散的最强预测因子。转录组分析揭示CTCs存在翻译抑制现象，特别是在mCTCs中核糖体蛋白显著下调，而eCTCs则通过mTORC1和ATF4信号维持翻译活性。组蛋白修饰酶KDM3B的普遍上调提示表观遗传调控在CTCs适应性中起关键作用。这些发现为针对CTCs播散脆弱性（如mTOR抑制剂、KDM3B抑制剂）的治疗策略提供了理论依据。

结论

CTCs的EMT异质性在乳腺癌播散过程中具有重要临床意义，特别是与淋巴结状态和分子亚型密切相关。翻译重编程和mTORC1信号通路的表型特异性调控为靶向治疗提供了新方向。