通过遗传工程在木质素中引入香豆素发光团实现光物理性质调控与功能化应用

时间：2025年10月6日

来源：Plant Biotechnology Journal

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本研究通过过表达Feruloyl-CoA 6′-Hydroxylase（F6′H1）基因，在杂交杨木质素中成功整合香豆素衍生物scopoletin结构单元。转基因木质素（CEL）在溶液和聚合物体系中均表现出显著增强的光致发光（PL）强度、红移发射波长、独特的抗猝灭特性以及可逆的光二聚化反应，为开发生物质基光学材料提供了创新策略。

1 引言

木质素作为木质生物质细胞壁的主要组分，是地球上最丰富的天然芳香聚合物。传统遗传工程主要关注改善木质素的降解性和加工性，例如通过调控芥子醇/愈创木基比例、缩短侧链或构建线性化结构。然而，针对其功能化特性（如抗氧化性、两亲性或光学特性）的遗传修饰研究尚属空白。

本研究创新性地通过过表达拟南芥来源的Feruloyl-CoA 6′-羟化酶（F6′H1）基因，在杂交杨（Populus tremula × tremuloides T89）木质素中引入天然发光团scopoletin（7-羟基-6-甲氧基香豆素）。F6′H1作为2-酮戊二酸依赖型双加氧酶，催化木质素合成中间体阿魏酰-CoA（feruloyl-CoA）转化为6′-羟基阿魏酰-CoA，进而通过自发异构化和内酯化形成scopoletin。该策略不仅为多糖高效利用提供新途径，更开创了通过遗传工程调控木质素光物理性质的先河。

2 结果与讨论

2.1 F6′H1过表达杨树的木质素提取

通过热解气相色谱-质谱（Py-GC/MS）分析，选择scopoletin积累水平为"低"（#12系）和"中"（#6系）的转基因株系，与野生型（WT）进行对比。高积累系因严重矮化被排除。转基因木质素含量略低于WT，且木质部呈现典型的木质素修饰转基因植物红化现象。经溶剂预处理确保去除游离scopoletin单体后，检测到的scopoletin确证已通过醚键整合入木质素大分子。

从转基因杨树提取的纤维素酶解木质素（CEL）在粉末状态和二甲亚砜（DMSO）溶液中均呈现颜色加深，表明F6′H1木质素发色团发生显著改变。

2.2 溶液体系中的紫外-可见吸收与光致发光特性

在0.1 mg·mL^-1 DMF溶液中，WT CEL在280 nm处显示吸收肩峰，在320 nm激发下于367 nm处产生PL峰。F6′H1系CEL在350 nm处出现与scopoletin标准品一致的吸收峰，PL强度显著增强且发射波长红移（#6系达451 nm）。添加10% scopoletin单体的WT CEL溶液虽能模拟#12系的PL谱，但与#6系差异显著，排除激基复合物形成可能（寿命测定：τ_WT=2.52 ns, τ_#6=2.50 ns）。

尺寸排阻色谱（SEC）分析揭示发光团具有宽摩尔质量分布（WT M_w=8790, #12 M_w=5680, #6 M_w=3460），且PL信号在全分子量范围均被检测到。在低极性溶剂（二氯甲烷、氯仿、正己烷）中，WT CEL因聚集导致严重荧光猝灭，而F6′H1系尤其#6系在ε=1.9的正己烷中仍保持明显PL，证明scopoletin单元在木质素中的均匀分布有效避免了浓度猝灭。高浓度实验（5 mg·mL^-1 DMF）和旋涂成膜实验进一步证实该抗猝灭特性。

2.3 水溶液中的光学性质

scopoletin的酚羟基使其光学性质具有pH依赖性。酸性条件（pH=3）下吸收峰位于340 nm，碱性条件（pH=11）下因去质子化红移至385 nm。甲基化scopoletin（6,7-二甲氧基香豆素）无此现象。F6′H1#6 CEL在碱性条件下显示300 nm和400 nm吸收增强，PL强度增加近10倍，证实部分整合的scopoletin保留游离酚羟基。在有机溶剂中添加乙酰胺模拟pKa变化也观察到类似趋势。

2.4 聚合物体系中的光学表现

将CEL与聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）共混制成透明薄膜，F6′H1#6薄膜显示最强PL发射。使用不同溶剂（DMF、CHCl₃）制备的PMMA薄膜PL强度差异反映溶剂极性影响，而聚乙烯醇（PVA） hydrophilic薄膜的PL谱形和强度变化表明聚合物本体性质对木质素发光行为具有调控作用。

2.5 香豆素修饰木质素的光二聚化反应

scopoletin乙醇溶液在365 nm照射120分钟后，350 nm吸收降低而330 nm吸收增加；经254 nm照射后光谱可逆恢复，证实典型香豆素光二聚化反应。F6′H1#6 CEL乙醇溶液呈现类似可逆变化，而WT CEL无明显响应，证明木质素整合的scopoletin单元仍保持光反应活性。该特性为开发光可逆材料、荧光探针、药物递送系统等提供全新思路。

3 实验方法

通过农杆菌介导转化获得转基因杂交杨，经组织培养和温室培育后采集茎干。制备无提取物木粉，采用乙酰溴法测定木质素含量，Py-GC/MS检测scopoletin整合量，纤维素酶解法提取CEL。使用紫外-可见光谱仪和荧光光谱仪分析溶液及薄膜光学性质，SEC-UV/荧光联用分析分子量分布， streak scope测定荧光寿命。光二聚化实验采用365 nm和254 nm交替照射监测光谱变化。