在肿瘤微环境这个复杂的生态系统中，免疫细胞的功能状态决定着肿瘤的命运。其中，髓系细胞作为免疫系统的重要成员，却常常被肿瘤"驯化"成为帮助肿瘤逃避免疫攻击的帮凶。这种免疫抑制现象的背后机制一直是科学家们探索的重点。近年来，淀粉样蛋白——这类原本以神经退行性疾病中异常沉积而闻名的蛋白质，被发现可能在肿瘤免疫中扮演着神秘角色。传统观点认为，淀粉样蛋白主要是错误折叠蛋白质的病理沉积物，与阿尔茨海默病、帕金森病和朊病毒病等神经退行性疾病密切相关。然而，越来越多的证据表明，这些蛋白不仅仅是错误折叠的副产物，而是能够调节细胞活动和组织稳态的重要调节因子。在癌症生物学中，淀粉样蛋白的作用尤其复杂多变：有些促进肿瘤生长，如淀粉样前体蛋白(APP)在晚期乳腺癌中上调；血清淀粉样A(SAA)水平与肾细胞癌和消化系统癌症的不良预后相关；而另一些如淀粉样β(Aβ)、胰岛淀粉样多肽(IAPP)和降钙素(CT)却能抑制胰腺癌细胞增殖。在这其中，胱抑素C(cystatin C)作为一个典型的淀粉样蛋白，其角色格外引人注目。由CST3基因编码的胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也是遗传性胱抑素C淀粉样血管病(HCCAA)的相关蛋白。流行病学研究将胱抑素C表达升高与全因和癌症特异性死亡率增加相联系，但它同时具有肿瘤抑制和促进的双重功能：一方面通过抑制半胱氨酸组织蛋白酶来抑制肿瘤侵袭和转移；另一方面又通过增强癌细胞在放疗中的存活来促进肿瘤生长。为了解开这个谜团，研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表了他们的最新发现，揭示了寡聚化胱抑素C如何通过与免疫抑制受体相互作用来重塑肿瘤免疫微环境。研究人员运用了多种关键技术方法：通过流式细胞术分析免疫细胞表面标志物和功能状态；采用免疫共沉淀和pull-down实验验证蛋白质相互作用；使用报告基因系统检测受体激活情况；建立基因敲除小鼠模型和转基因小鼠模型进行体内功能验证；通过ELISA和磷酸化蛋白检测分析信号通路活化；利用TCGA数据库进行临床相关性分析；并采用人源化小鼠模型评估治疗策略的潜在效果。样本来源包括健康供者和癌症患者的外周血样本，以及各种肿瘤细胞系。Oligomeric cystatin C binds to the inhibitory receptors LILRB2 and LILRB5研究发现，癌症患者血清中胱抑素C水平显著升高，且在肿瘤组织中存在明显的胱抑素C寡聚化现象。通过流式细胞术分析，研究人员发现EX-CELL培养基来源的寡聚胱抑素C能够与单核细胞和中性粒细胞显著结合，而与DMEM培养基中的单体形式结合较弱。基因组筛选将白细胞免疫球蛋白样受体B亚族(LILRB)成员鉴定为胱抑素C的潜在相互作用伙伴。通过免疫共沉淀实验，研究人员证实了胱抑素C与LILRB2和LILRB5的直接相互作用，其中L68Q突变体(与遗传性胱抑素C淀粉样血管病相关)与受体的结合更强。结合实验表明，寡聚形式是主要的结合形式。进一步研究发现，LILRB2通过其N端D1D2结构域与胱抑素C结合，而LILRB5则通过C端D3D4结构域结合，表明这两种受体虽然共享配体，但结合机制不同。Oligomeric cystatin C induces downstream signaling via LILRB2 and LILRB5 inhibitory receptors为了确定寡聚胱抑素C是否能激活LILRB2和LILRB5介导的信号传导，研究人员使用了敏感的嵌合受体报告系统。结果显示，可溶性胱抑素CEX能有效诱导LILRB2和LILRB5报告细胞激活，而这种激活可被抗LILRB2和抗LILRB5阻断抗体消除。在HEK293T细胞中重建LILRB信号组件后发现，胱抑素C寡聚体诱导LILRB2特异性酪氨酸磷酸化并促进SHP-1招募。在稳定表达LILRB2或LILRB5的THP-1细胞中，胱抑素C包被板能持续诱导受体的酪氨酸磷酸化。这些结果确立了寡聚胱抑素C作为功能性细胞外配体，能结合并激活抑制性受体LILRB2和LILRB5，促进下游免疫抑制信号传导。Oligomeric cystatin C enhances LILRB2-dependent immunosuppressive myeloid cell activity and T-cell suppression研究发现，寡聚胱抑素C通过LILRB2显著抑制GM-CSF诱导的M1巨噬细胞分化特征，包括抑制CD86表达、维持CD14表达和阻止CD163下调。这些效应都能被抗LILRB2处理逆转。在树突状细胞分化过程中，胱抑素CEX处理抑制了CD14的下调和CD40、CD86的上调，表明其通过LILRB2损害DC分化。在中性粒细胞极化实验中，胱抑素CEX显著抑制了N1极化特征(CD62Lneg/low表达和CD16下调)，同时上调了N2中性粒细胞标志物CXCR2(CD182)的表达。功能实验表明，胱抑素CEX显著抑制中性粒细胞脱颗粒和内吞作用，同时促进中性粒细胞迁移。在T细胞增殖实验中，单核细胞和胱抑素CEX的共同存在显著抑制了T细胞增殖，这种效应可被LILRB2阻断部分逆转。来自癌症患者的髓系来源抑制细胞(MDSC)实验进一步证实，胱抑素CEX增强了MDSC介导的T细胞增殖和功能抑制，且这种免疫抑制效应可被抗LILRB2处理部分逆转。CST3 silencing inhibits tumor growth in mouse models在B16-F10黑色素瘤模型中，研究人员发现胱抑素C在肿瘤进展过程中发生中度寡聚化。通过生成CST3敲除(cystatin C-/-)小鼠，他们发现虽然cystatin C-/-小鼠外观、器官大小和繁殖频率正常，但在接种sgCST3 B16-F10细胞时，肿瘤生长和终点肿瘤重量显著降低。免疫分析显示，胱抑素C缺失导致肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、多形核髓系来源抑制细胞(PMN-MDSC)和调节性T细胞(Treg)显著减少，但增加了CD8+ T细胞和自然杀伤(NK)细胞的浸润。同时，cystatin C-/-小鼠肿瘤微环境中IFN-γ+、穿孔素+和颗粒酶+ CD8+ T细胞百分比显著增加，脾脏Mac1+Gr-1+髓系细胞中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-12表达显著增加。CST3 overexpression promotes tumor growth in LILRB2- and LILRB5-transgenic mice通过在LILRB2转基因(LILRB2KI)和LILRB5转基因(LILRB5KI)小鼠中强制表达人胱抑素C，研究人员发现人胱抑素C在B16-F10或CT-2A细胞中的强制表达显著加速了LILRB2KI小鼠的肿瘤生长，但在WT小鼠中没有这种效应。流式细胞分析显示，B16-F10-hcystatin C过表达显著增加了LILRB2KI小鼠中LILRB2+髓系细胞的比例，表明免疫抑制性肿瘤微环境的增强。进一步分析发现，免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和PMN-MDSC增加，同时免疫刺激性T细胞减少。髓系细胞中CD80表达下调，CD14和CD206表达上调，磷酸化STAT3水平显著升高。抗LILRB2治疗显著延迟了LILRB2KI小鼠中B16-F10-hcystatin C肿瘤进展，而B16-F10-hcystatin C肿瘤生长在LILRB5KI小鼠中加速。CST3 overexpression promotes tumor growth in humanized mice通过TCGA数据分析，研究人员发现高CST3表达与食管癌、胶质母细胞瘤、肾透明细胞癌、低级别胶质瘤、肝癌、肺鳞状细胞癌、胃癌和眼黑色素瘤患者的总生存期负相关。CST3表达与LILRB2或LILRB5表达呈正相关，特别是在LILRB2中。在人源化小鼠模型中，强制表达人胱抑素C显著加速了hCD34+人源化小鼠的肿瘤生长，但在NSG-SGM3小鼠中没有这种效应。抗LILRB2阻断抗体治疗显著延迟了SK-MEL-5-hcystatin C肿瘤生长，表明靶向胱抑素C-LILRB2相互作用可能是一种有前景的癌症免疫治疗策略。The cystatin C-LILRB2 axis enhances TGF-β signaling in myeloid cells研究发现LILRB与TGF-β受体相互作用并调节TGF-β信号通路。免疫共沉淀实验表明，LILRB与TGF-βRI和TGF-βRII都有相互作用，其中与TGF-βRI的关联更强。这种相互作用可被抗LILRB2阻断抗体部分抑制。进一步实验发现，TGF-βRI的胞外结构域是与LILRB2结合所必需的。LILRB2以剂量依赖性方式促进TGF-βRI向TGF-βRII的招募。在THP-1和THP-1-LILRB2细胞中，TGF-β1刺激后，SMAD2磷酸化在THP-1-LILRB2细胞中显著更强，而非经典信号通路激活没有变化。值得注意的是，寡聚胱抑素C显著增强了LILRB2与TGF-βRI之间的顺式和反式相互作用。在原代中性粒细胞和单核细胞中，胱抑素CEX处理后SMAD2/SMAD3磷酸化显著增加，这种增加可被LILRB2阻断部分逆转。Oligomeric transthyretin binds to the inhibitory receptors LILRB2 and LILRB5研究人员还发现，另一种淀粉样蛋白转甲状腺素蛋白(TTR)的寡聚体也能与LILRB2和LILRB5受体结合。通过引入F87M/L110M突变促进TTR寡聚化，发现只有寡聚形式的TTRF87M/L110M能与LILRB2和LILRB5强效结合。非致病性T119M突变和FDA批准的治疗药物Tafamidis都能抑制TTR寡聚化并减少其与LILRB2和LILRB5的结合。研究结论表明，寡聚化胱抑素C通过结合LILRB2和LILRB5抑制性受体增强髓系细胞免疫抑制活性，这一发现扩展了淀粉样蛋白的功能谱系，强调了这些蛋白在免疫逃逸和癌症发展中的重要性。机制上，胱抑素C-LILRB2信号传导由经典磷酸酶和增强的TGF-β通路共同驱动。更重要的是，研究发现LILRB受体与转甲状腺素蛋白(TTR)寡聚体之间的相互作用，表明淀粉样蛋白-LILRB相互作用可能是更广泛的模式。这些发现揭示了寡聚胱抑素C在增强髓系细胞免疫抑制中的意外作用，为开发靶向胱抑素C寡聚化和阻断LILRB2/LILRB5信号传导的治疗策略提供了理论基础，对于治疗胱抑素C相关癌症具有重要意义。该研究不仅揭示了淀粉样蛋白在肿瘤免疫微环境中的新功能，还为理解多种淀粉样蛋白疾病的免疫调节机制提供了新视角，为开发针对淀粉样蛋白-免疫受体轴的新型治疗策略奠定了坚实基础。
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