单倍型解析的无间隙基因组组装揭示亚洲梨与欧洲梨的遗传分化机制

时间：2025年8月7日

来源：Nature Genetics

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本研究通过构建亚洲梨'砀山酥梨'(Pyrus bretschneideri)和欧洲梨'Max Red Bartlett'(Pyrus communis)的端粒到端粒(T2T)单倍型解析基因组，解决了高杂合度导致参考基因组不完整的问题。研究人员利用PacBio HiFi、ONT超长读长和Hi-C技术，获得了两品种各两个单倍型的无间隙组装（contig N50≥28.96 Mb），发现单倍型特异性基因在转座子含量、甲基化模式和表达水平上存在显著差异。通过群体分析（362份种质）和SV-GWAS，鉴定出与果实软化相关的PyACS1基因启动子区286-bp插入序列，证实其通过PybHLH94转录因子调控乙烯合成。该研究为梨的遗传改良提供了重要资源，发表于《Nature Genetics》。

梨作为典型的自交不亲和作物，其高度杂合的特性使得基因组组装和遗传分析面临巨大挑战。现有参考基因组存在大量缺口，且传统混合组装策略难以解析等位基因变异。亚洲梨与欧洲梨在果实质地、糖酸组成等农艺性状上差异显著，但控制这些性状的遗传基础尚不明确。

南京农业大学园艺学院的研究团队选取代表性品种'砀山酥梨'（亚洲梨）和'Max Red Bartlett'（欧洲梨），采用多组学技术构建了单倍型分辨率的无间隙基因组。通过PacBio HiFi（高精度长读长）、Oxford Nanopore（超长读长）和Hi-C（三维基因组）技术，获得四个单倍型的高质量组装（基因组大小497.50-505.55 Mb），填补了此前参考基因组中18.89-24.13 Mb的缺失区域。LTR组装指数（LAI）达21.38-24.31，BUSCO完整性达97.9-98.6%，证实了组装的完整性。

研究采用hifiasm和Verkko混合组装策略，结合RNA-seq和甲基化测序分析基因功能。对362份梨种质（包括137份新测序和225份公开数据）进行群体遗传分析，利用minigraph构建图基因组鉴定结构变异（SV）。通过转基因番茄验证候选基因功能，采用双荧光素酶报告系统（LUC）和电泳迁移率实验（EMSA）解析调控机制。

单倍型特异性基因的差异特征

比较两品种的单倍型发现，1,703-1,994个单倍型特异性基因相比双等位基因具有更高的转座子（TE）含量（基因上下游5kb及编码区）和DNA甲基化水平（图2c）。这些基因在"生物刺激响应"（GO term）和"次生代谢物合成"（KEGG pathway）中富集，表达量普遍低于双等位基因（FPKM降低34.7-41.2%），表明表观沉默可能限制其功能发挥。

等位基因特异性表达模式

在果实发育8个阶段中，26.21%基因表现等位基因特异性表达（ASE），其中95.26%为单倍型主导型（HapDom）。值得注意的是，木质素合成关键基因C3H（Pbre1_15G769200）和4CL（Pbre1_13G264800）在发育早期（S1-S2）呈现HapB等位优势（图2h），而糖转运蛋白SWEET2在成熟期表现HapA偏好性，揭示等位基因剂量效应对果实品质形成的关键作用。

亚洲与欧洲梨的进化分歧

系统发育分析表明，亚洲梨与欧洲梨约在360万年前分化。群体遗传分析（图4a）将362份种质分为6个亚群，其中栽培秋子梨（P.ussuriensis）表现出野生秋子梨与沙梨（P.pyrifolia）的混合遗传背景，Treemix检测到从白梨（P.bretschneideri）向秋子梨的基因流（迁移权重=0.32），说明种间渗入促进了性状改良。阶梯图分析显示，亚洲野生梨群体在250-160ka经历瓶颈效应后快速扩张，与末次间冰期气候变暖吻合。

果实品质相关的选择信号

选择清除分析鉴定出21.31 Mb（亚洲梨）和14.59 Mb（欧洲梨）的驯化区间。在16号染色体上，苹果酸酶Ma1（Pbre1_16G081600）和果实大小调控因子fw2.2（Pbre1_16G040200）同源基因受到选择（图4d），与苹果驯化呈现趋同选择。石细胞相关基因PbrbZIP48和miR397a在栽培种中受选择，后者通过沉默漆酶基因（LAC）降低木质素沉积。

结构变异与农艺性状关联

基于图基因组的SV-GWAS发现：

2号染色体66-bp缺失与果实横径（FTD）显著相关（P=1.20×10^-5），缺失型个体PyTPR（编码TPR蛋白）表达量降低81.85%（图5f），导致细胞扩张受阻；
15号染色体1,016-bp缺失使可溶性固形物（SSC）增加2.3°Brix，该变异位于bZIP转录因子（PybZIP6）下游，其在果实后期高表达（图5j）；
欧洲梨特异的286-bp插入序列位于PyACS1（ACC合成酶）启动子区（-1,141至-855bp），携带G-box（CACGTT）和E-box（CATTTG）元件（图6h）。

PyACS1调控果实软化的机制

转基因番茄过表达PyACS1导致乙烯释放量增加3.2倍，果实硬度降低38%（图6e-g）。双荧光素酶实验证实，PybHLH94仅能激活含286-bp插入的PyACS1_proMRB（荧光值提升6.8倍），而对亚洲梨型启动子无活性（图6k）。EMSA进一步验证PybHLH94直接结合插入序列中的顺式元件（图6m），解释欧洲梨采后快速软化的分子基础。

该研究首次在梨中实现单倍型水平的T2T基因组组装，揭示等位基因变异对果实品质的调控网络。发现的286-bp插入序列可作为分子标记辅助育种，而构建的图基因组为复杂性状研究提供新范式。PyACS1-PybHLH94模块的阐明，为调控果实成熟进程提供了精准靶点，对蔷薇科作物遗传改良具有普遍指导意义。