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研究人员针对传统蛋白结合剂发现方法耗时长、成本高且成功率低的问题，开发了名为PANCS-Binders的噬菌体辅助非连续选择平台。该技术通过将M13噬菌体生命周期与分裂RNA聚合酶生物传感器偶联，可在2天内完成1011个蛋白互作对的筛选，成功获得52个靶点的数百种新型结合剂，亲和力最低达206 pM。这项发表于《Nature Methods》的研究显著加速了蛋白结合剂的发现进程，为生物医学研究提供了强大工具。
在生物医学研究和药物开发领域，能够特异性结合靶标蛋白的分子工具具有不可替代的价值。这类被称为"蛋白结合剂"的分子，包括抗体、affibody等，被广泛应用于基础研究、诊断检测和药物治疗等多个方面。然而，传统蛋白结合剂的开发面临着诸多挑战：通过动物免疫制备抗体通常需要数月时间，花费数千美元；而体外展示技术虽然避免了动物实验，但仍需数月时间且假阳性率高。更令人困扰的是，即使对于研究最为深入的人类蛋白质组，仍有大量蛋白缺乏高质量的结合剂。这严重限制了科学家们探索生命奥秘和开发新型疗法的能力。
芝加哥大学的研究团队在《Nature Methods》发表了一项突破性研究，开发出名为PANCS-Binders（噬菌体辅助非连续选择蛋白结合剂）的革命性平台。该技术巧妙地将M13噬菌体的生命周期与分裂RNA聚合酶（RNAP）生物传感器相偶联，创建了一个高效、可靠的蛋白结合剂发现系统。研究人员通过该系统成功筛选出针对52个不同靶标的数百种新型结合剂，其中包括KRAS G12D和Mdm2等重要靶点，部分结合剂的亲和力达到皮摩尔级别（206 pM）。更令人振奋的是，整个筛选过程仅需2天即可完成，相比传统方法效率提升数十倍。
研究采用了几个关键技术方法：1）构建噬菌体编码的蛋白变体文库（108-1010规模）；2）开发基于分裂RNAP的生物传感器系统，将蛋白结合活性与噬菌体复制偶联；3）建立非连续传代选择（PANCS）流程；4）应用表面等离子体共振（SPR）验证结合亲和力；5）在哺乳动物细胞中验证结合剂功能。
研究结果部分，文章通过多个方面展示了PANCS-Binders平台的强大性能：
"优化PANCS-Binders"部分详细描述了技术开发过程。研究人员首先尝试使用连续进化（PACE）方法筛选新结合剂，但发现该方法无法有效筛选超大文库（107以上）。通过构建模拟选择系统，发现非连续传代选择（PANCS）能更有效地富集活性噬菌体。优化后的PANCS-Binders可在4轮传代（48小时）内实现>1015倍的活性噬菌体富集，同时完全淘汰非结合噬菌体。
"初步de novo文库PANCS-Binders"部分展示了技术验证结果。研究人员使用108规模的affibody文库针对6个靶标进行筛选，成功获得KRAS4b(G12D)、RAF(RBD)、IFNG和Mdm2的结合剂。通过下一代测序（NGS）发现筛选高度重复（r=0.72-0.95），表面等离子体共振（SPR）测定结合亲和力在176-635 nM范围。有趣的是，AlphaFold3预测的结合界面与实验结果相符。
"高通量PANCS"部分展示了技术的规模化应用能力。研究人员构建了包含95个靶标的面板，使用affibody和affitin两种文库（各108变异体）进行96孔板形式的并行筛选。结果显示55%的成功率，验证了79种新结合剂针对52个靶标。特别值得注意的是，这些靶标涵盖了从分泌蛋白到膜蛋白、从有序结构到完全无序蛋白的广泛类型，展示了平台的广泛适用性。
"提高PANCS-Binders的亲和力和命中率"部分探讨了技术优化空间。通过将文库规模扩大100倍（至1010），研究人员将命中率提高到72%，并获得亲和力提高40-2000倍的结合剂（最低Kd=0.2 nM）。此外，通过PACE对Mdm2结合剂进行亲和力成熟，获得了>20倍亲和力提升的变体（最佳Kd=8.4 nM）。
"结合剂在哺乳动物细胞中的功能"部分验证了实际应用价值。KRAS G12D结合剂在HEK293T细胞中显示出特异性结合；当融合LC3B相互作用区（LIR）基序后，能有效降解内源性KRAS。Mdm2结合剂不仅与靶标共定位，还能抑制Mdm2-p53相互作用，激活p53信号通路。
这项研究的意义在于：1）解决了蛋白结合剂开发的速度瓶颈，将数月流程缩短至2周；2）突破了传统方法对靶蛋白可溶性和纯度的限制，可直接使用质粒表达的靶标；3）通过并行筛选大幅提高了发现效率；4）获得的结合剂可直接应用于哺乳动物细胞系统。PANCS-Binders平台的出现，将使蛋白结合剂的开发从需要专业技术的专门工作转变为常规实验室方法，有望极大促进蛋白质组学研究和靶向治疗开发。正如作者所言，这项技术可能"释放工程化结合剂生物技术在蛋白质组靶向中的新创造潜力"。
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