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大规模解析人类多能干细胞中 Y 染色体缺失：对特纳综合征和核糖体病的重要启示

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这篇研究通过分析超 2650 份人类胚胎干细胞（hESCs）的 RNA 测序（RNA-seq）样本，发现 12% 的未分化样本存在 Y 染色体缺失（LOY）。LOY 会导致多能性降低和核糖体蛋白基因下调，且在特纳综合征和戴蒙德 - 布莱克范贫血样本中也有类似现象，为相关疾病研究提供了新视角。

研究背景

研究方法

1. 数据采集与归一化：从 NCBI 的序列读取存档（SRA）下载 RNA-seq 样本，利用 Run Selector 工具筛选。通过 STAR aligner 将样本分别比对到人类 GRCh38（v.42）基因组和小鼠 GRCm39 基因组，再用 XenofilteR 工具排除来自小鼠胚胎成纤维细胞的 reads。使用 featurecounts 工具生成计数表，经 TPM 归一化后，计算 Y 染色体特异性基因表达比值（chrY ratio）。
2. SNP 鉴定与等位基因表达分析：利用 GATK 工具处理已对齐的 BAM 文件生成 VCF 文件，包含样本的变异信息。用 R 语言的 vcfR 包生成归一化 SNP 矩阵，计算距离矩阵，根据样本聚类情况判断样本标签是否正确。对于可能误标样本，计算 X 连锁基因的等位基因比率以确定性别。
3. TP53 突变鉴定：运用 RNA2CM 管道和 COSMIC 参考注释，分析 RNA-seq 样本中 TP53 基因突变率。
4. eSNP - 核型分析与染色体畸变计算：采用 eSNP-Karyotyping 方法，利用 eSNPkaryotyping R 包分析具有足够 SNP 覆盖度样本的 VCF 文件，生成移动平均图，计算染色体畸变率。
5. 差异表达分析：计算 LOY 与野生型（WT）样本中各基因的表达差异倍数，用 Mann-Whitney 非参数检验计算显著性，经 FDR 校正。使用 fgsea 包进行基因集富集分析。
6. DBA 样本的伪批量 RNA 分析：下载相关研究的样本和计数表，筛选符合条件的样本，将来自同一患者或健康个体的单细胞合并为伪批量样本，进行归一化和分析。

研究结果

1. hESCs 中 LOY 的分析：分析 834 份男性 hESC 样本和 1827 份分化衍生物样本，根据 chrY ratio 将样本分为野生型（chrY ratio＞0.5）、完全 LOY（fLOY；chrY ratio＜0.15）和部分 LOY（pLOY；0.15＜R＜0.5）。pLOY 和 fLOY 分别占所有 hESC 样本的 6.5% 和 5%，在不同研究和细胞系中均有发现。经验证，排除部分误标样本后，在常用的男性细胞系 WA01、HNES1 和 HUES8 中也检测到 LOY。进一步分析发现，LOY 样本中 Y 特异性基因均显著下调，在 fLOY 样本中甚至完全失去表达。
2. LOY 样本的遗传和染色体完整性评估：检测 LOY 样本中 TP53 突变情况，发现 LOY 样本与 WT 样本的 TP53 突变率差异不显著，表明 LOY 不是由 TP53 突变导致的基因组不稳定的副产物。通过 eSNP-Karyotyping 分析发现，LOY 与非 LOY 样本在常染色体畸变积累上无显著差异，也未检测到与 LOY 相关的特定畸变。此外，LOY 与传代次数和生长培养基条件有关，样本在 30 代以后才出现 LOY，且在饲养层细胞上生长的样本中 LOY 高度富集。
3. 分化细胞中 LOY 的鉴定：在所有三个胚层中均检测到 pLOY 和 fLOY，但在生殖细胞和滋养层分化样本中未观察到。这可能是因为 Y 染色体上的某些基因（或其在 chrX 上的对应基因）对生殖细胞分化和胎盘发育至关重要，缺乏 Y 染色体会干扰这些过程，但由于样本数量较少，该影响尚不显著。
4. hESCs 中 LOY 的功能相关性：对 LOY 和 WT 样本进行差异表达分析，基因本体富集分析显示，LOY 样本中分化相关术语上调，细胞周期、凋亡、DNA 和染色体组织相关术语以及核糖体蛋白（RP）基因显著下调。LOY 细胞中关键多能性标记物 NANOG 和 POU5F1 等表达显著降低。同时，LOY 样本中 Y 连锁肿瘤抑制基因表达下调，其 X 连锁同源基因表达增加，这种下调可能使 LOY 细胞具有选择性优势。
5. LOY 样本和特纳综合征细胞中 RP 基因的表达分析：核糖体由核糖体 RNA 和 80 种 RP 组成，参与细胞翻译过程。在 LOY 的未分化胚胎干细胞及其分化衍生物的三个胚层中，几乎所有 RP 编码基因均显著下调。特纳综合征（45,XO）样本同样存在 RP 基因表达下调的情况，且与 LOY 样本中 RP 基因的下调模式具有相关性。
6. 常染色体核糖体病中 RP 基因的表达：研究发现，在钻石 - 黑范贫血（DBA）这种常染色体 RP 基因单倍体不足的核糖体病患者样本中，大多数 RP 基因转录显著下调，即使患者携带不同的突变，且不仅突变的 RP 基因转录下调，其他多数 RP 基因也受影响。

研究讨论

1. LOY 的发生机制与影响：研究表明，LOY 在 hESCs 样本中较为常见，且并非由技术因素或样本误标导致。推测 LOY 可能起源于克隆事件，在培养过程中逐渐扩展，这一推测得到了 LOY 在后期传代样本和饲养层细胞培养样本中富集的支持。LOY 可能赋予细胞增殖优势，其机制可能与 Y 连锁肿瘤抑制基因的单倍体不足以及 X 连锁同源基因的补偿不足有关，但仍需进一步研究验证。
2. LOY 对基因表达和细胞功能的影响：尽管 Y 染色体较小且广泛表达的基因较少，但其缺失对 hESCs 的基因表达模式影响显著，导致多能性标记物和主要多能性网络调节因子下调，同时大多数 RP 基因表达下调。这种 RP 基因转录下调现象在特纳综合征和 DBA 样本中也存在，提示可能存在一种新的机制，即一个 RP 基因拷贝的缺失会影响其他核糖体基因的转录，可能是 RP 单倍体不足的下游事件，也可能是细胞生长停滞导致翻译机制下调的结果。
3. 研究的局限性与展望：本研究存在一定局限性，如仅通过 RNA-seq 样本判断 LOY，无法完全排除 chrY 表观遗传沉默而非丢失的可能性；未检测 RP 蛋白水平，也无法分析 rRNA 转录的变化。未来研究可针对这些方面展开，深入探讨 LOY 对细胞功能的影响，以及 RP 基因转录下调的具体机制。
4. 研究的临床意义：LOY 样本中多能性基因标记物的减少和核糖体缺陷可能对使用 LOY 细胞进行疾病建模和细胞治疗产生重要影响。因此，在使用男性 hESCs 时，应考虑 Y 染色体的存在情况，以避免对研究和治疗结果产生干扰。

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